Name: histological-based stainings using free-floating tissue sections
Uploaded: 2020-08-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections at JoVE.com

ברצוננו להודות למכון הלאומי להזדקנות (K99/R00 AG055683 ל-JMR), למכון ג'ורג' ואן ריאן למדעי המוח (EP, GC, JMR), למכללה לרוקחות באוניברסיטת רוד איילנד (EP, GC, JMR) ול-Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). אנו מודים לדוקטורנטית רבקה סנפט, בהכשרתה עם פרופ' סוזן דימצקי, המחלקה לגנטיקה, בית הספר לרפואה של הרווארד, על שהכירה לנו את שיטת הציפה החופשית. חלק מהתמונות ששימשו באיור 1 התקבלו ממקורות "חופשיים לשימוש, לשיתוף או לשינוי, אפילו מסחריים": עכבר ושפופרת מיקרוצנטריפוגה (Pixabay), מוח עכבר (Jonas Töle, Wikimedia Commons), אזור מוח קריוסטט ועכבר (מרכז DataBase למדעי החיים, ויקישיתוף), מיכל זכוכית (OpenClipart, FreeSvg.org) ומיקרוסקופ (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. הכנת רקמות להקפאה
<ol><li>הטמיעו רקמות קבועות בתבנית הטבעה מתאימה (ראו טבלת חומרים) ליצירת גוש דגימה באמצעות מטריצת דגימות מתאימה (ראו טבלת חומרים) והקפיאו על קרח יבש. אחסנו את גושי הדגימה בטמפרטורה של -80°C עד שהם מוכנים לחתוך. הערה: רקמות קבועות מוכנות בדרך כלל על ידי ניק...

<ol>
	<li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV:+Techniques+in+Experimental+Pathology.">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group.">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies:+indispensable+tools+for+biomedical+research.">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li><li>Taylor, S. N., Harlow, E. D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Antibodies:+A+Laboratory+Manual.">Using Antibodies: A Laboratory Manual.</a> The Quarterly Review of Biology. 74 (3), 374 (1999).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Hermersd&#246;rfer, H., Beesley, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunocytochemistry. A Practical Approach. 38 (3), 348-348 (1994).</li><li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+Immunohistochemistry.">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Review+of+Cytology.">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li><li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections.">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry.">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).</li><li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, 43-55 (2020).</li><li>H&#246;kfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues.">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons.">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin.">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li><li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focus+on+fixation.">A focus on fixation.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li><li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry.">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections.">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fos:+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections.">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li><li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides.">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li><li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation.">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li><li>Desmet, V. J., Krstulovi&#263;, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+(ANIT)+induced+cholestasis.">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li><li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat.">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li><li>L&#246;nnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney.">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li><li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+(GnRH)+and+Pro-GnRH,+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain.">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li><li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue.">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li><li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity.">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li><li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain:+a+light+and+electron+microscopic+study.">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li><li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum.">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li><li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury:+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers.">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li><li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo.">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li><li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology.">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li><li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry.">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry.">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li><li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papel+da+imuno-histoqu&#237;mica+no+diagn&#243;stico+do+c&#226;ncer+de+pulm&#227;o.">Papel da imuno-histoqu&#237;mica no diagn&#243;stico do c&#226;ncer de pulm&#227;o.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).</li><li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures.">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).</li><li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , 207-262 (1981).</li><li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cresyl+violet:+A+red+fluorescent+Nissl+stain.">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li></ol>

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה רב-תכליתית שהפכה לחיונית בזיהוי ביטוי חלבונים ולוקליזציה בתוך חלקי רקמות. בדיקה זו משמשת ברחבי הקהילה המדעית כדי להבין עוד יותר מאפיינים של רקמה משלבים של תפקוד תקין למצבי מחלה. IHC מועסק במגוון תחומים, החל מאבחון קליני של מחלות כגון סרטן ועד תגליות ראשוניות...

Immunostaining היא פרקטיקה מחקרית פופולרית שהחלה לפני 130 שנה עם גילוי נוגדנים בסרום בשנת 1890 על ידי Von Behring1. בתחילת המאהה-20 הוצמדו צבעים לאנטיגנים ומאוחר יותר לנוגדנים כדרך לכמת ולדמיין תגובות1, ובשנת 1941 פיתח אלברט קונס את תוויות הנוגדנים הפלואורסצנטיות הראשונות, תגלית שחוללה מהפכה במיקרוסקופ אור 2,3. המונח "immunostaining" מקיף טכניקות רבות שפותחו באמצעות עיקרון זה, כולל כתם מערבי, ציטומטריית זרימה, ELISA, אימונוציטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה 3,4. כתם מערבי מזהה נוכחות של חלבונים ספציפיים מתמציות רקמות או תאים5. חלבונים מופרדים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל, מועברים לקרום ונבדקים באמצעות נוגדנים. טכניקה זו מצביעה על נוכחות של חלבון וכמה חלבון קיים; עם זאת, הוא אינו חושף מידע על לוקליזציה של החלבון בתוך תאים או רקמות. שיטה אחרת, אימונוציטוכימיה (ICC), מסמנת חלבונים בתוך תאים, בדרך כלל תאים המעובדים במבחנה. ICC מראה הן ביטוי חלבונים והן לוקליזציה בתוך תאים6. כדי לזהות ולדמיין חלבון מסוים ברמת הרקמה, נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה (IHC).
IHC היא שיטה שחוקרים משתמשים בה כדי להתמקד באנטיגנים ספציפיים בתוך רקמות, תוך ניצול התכונות הכימיות של מערכת החיסון 7,8. על ידי יצירת נוגדנים ראשוניים ומשניים ספציפיים הקשורים לאנזים או לצבע פלואורסצנטי, אנטיגנים בעלי עניין יכולים להיות מסומנים ומתגלים ברוב הרקמות (כפי שנסקר ב- Mepham ו- Britten)9. המונח "אימונוהיסטוכימיה" כשלעצמו אינו מפרט את שיטת הסימון המשמשת לחשיפת האנטיגן המעניין; לפיכך, מינוח זה משולב לעתים קרובות עם טכניקת הזיהוי כדי להגדיר בבירור את שיטת התיוג: אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית (CIH) כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לאנזים, כגון פרוקסידאז; או IHC פלואורסצנטי כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לפלואורופור, כגון פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) או טטרמתילרודאמין (TRITC). הסלקטיביות של IHC מאפשרת לרופאים ולחוקרים לדמיין ביטוי ופיזור חלבונים ברקמות, במצבי בריאות ומחלות שונים10. בתחום הקליני, IHC משמש בדרך כלל לאבחון סרטן, כמו גם לקביעת הבדלים בסוגים שונים של סרטן. IHC שימש גם כדי לאשר סוגים שונים של זיהומים מיקרוביאליים בגוף, כגון הפטיטיס B או C11. במחקר ביו-רפואי, IHC משמש לעתים קרובות למיפוי ביטוי חלבונים ברקמות והוא חשוב בזיהוי חלבונים חריגים הנראים במצבי מחלה. לדוגמה, ניוון עצבי מלווה לעתים קרובות בהצטברות של חלבונים חריגים במוח, כגון פלאקים Αβ וסבכים נוירופיברילריים במחלת אלצהיימר. מודלים של בעלי חיים מפותחים לעתים קרובות כדי לחקות מצבים פתולוגיים אלה, ו-IHC היא שיטה אחת שבה משתמשים החוקרים כדי לאתר ולכמת את החלבונים המעניינים 10,12,13. בתורו, אנו יכולים ללמוד יותר על הגורמים למחלות אלה, ואת הסיבוכים המתעוררים איתם.
ישנם שלבים רבים הכרוכים בביצוע IHC. ראשית, רקמת העניין נאספת ומוכנה להכתמה. ניתן לטעון שרוב החוקרים מכינים דגימות רקמה קבועות, כאשר זילוח של הקיבוע באמצעות מערכת הדם הוא אופטימלי מכיוון שהוא משמר מורפולוגיה14,15. ניתן להשתמש גם לאחר קיבוע של דגימות רקמה אך עשוי להניב תוצאות פחות מאידיאליות16. קיבוע צולב, כגון פורמלדהיד, פועל על ידי יצירת קשרים כימיים בין חלבונים ברקמה17. לאחר מכן פורסים רקמות קבועות לשכבות או מקטעים דקים מאוד באמצעות מיקרוטום, כאשר חוקרים רבים מעדיפים לאסוף חלקים קפואים באמצעות הקפאה. משם הרקמה נאספת ומורכבת ישירות על מגלשת מיקרוסקופ (שיטת החלקה על החלקה), או תלויה בתמיסה (שיטת ציפה חופשית), כגון מלח חוצץ פוספט (PBS)18. שיטת האיסוף בה נעשה שימוש נקבעת מראש על פי צרכי החוקר, כאשר כל אחת משתי שיטות אלה מציגה יתרונות וחסרונות משלה.
השיטה המותקנת בהחלקה היא ללא ספק הנפוצה ביותר, כאשר יתרון חשוב הוא שניתן להכין חלקים דקים מאוד (10-14 מיקרומטר), מה שחשוב, למשל, לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. יש גם טיפול מינימלי בדגימה, מה שמקטין את הנזק הפוטנציאלי לשלמות המבנית של הרקמה19. חוקרים משתמשים לעתים קרובות בטכניקה זו עם רקמה קפואה טרייה (רקמה שמוקפאת מיד באמצעות קרח יבש, איזופנטאן וכו '), שהיא עדינה מאוד בהשוואה לרקמה קבועה ויש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע הפשרה של הדגימה. יתרון נוסף של שימוש בחלקים המותקנים על שקופיות הוא שבדרך כלל אין צורך בכמויות גדולות של פתרונות לצביעה4. לכן, חוקרים יכולים להשתמש בכמות קטנה יותר של נוגדנים יקרים או כימיקלים אחרים כדי להשלים את הכתם. בנוסף, ניתן להעלות קטעים ממספר קבוצות ניסוי שונות על אותה שקופית, מה שיכול להיות יתרון, במיוחד במהלך רכישת תמונה. מצד שני, ישנם כמה חסרונות בשימוש במקטעים המותקנים על שקופיות, ובראשם שקטע הרקמה מוצמד לשקופית ובכך מגביל את חדירת הנוגדנים לצד אחד של המקטע, מה שמגביל את עובי הקטע ואת הייצוג התלת ממדי של הרקמה. זה יכול לקרות גם כי במהלך שטיפות, הקצוות של הרקמה וחלקים שלמים עשויים להתנתק מן השקופית, מה שהופך את הניסוי כולו חסר תועלת. יתר על כן, IHC בדרך כלל צריך להתבצע במהירות יחסית בעת שימוש בגישה המותקנת על שקופיות כדי למנוע השפלה של אפיטופ האנטיגן 20,21 עם שקופיות לא מעובדות המאוחסנות בדרך כלל ב -20 או -80 ° C, לעתים קרובות מכוסה ומאוחסן אופקית או בתיבות שקופיות, וכתוצאה מכך טביעת רגל אחסון גדולה יחסית. לבסוף, טכניקת ההרכבה על שקופיות יכולה גם לקחת זמן רב אם החוקרים צריכים לטפל במספר רב של שקופיות כדי לעבד מספר גדול של קטעי רקמות.
בשל חלק מהאתגרים הללו באמצעות שיטת ההרכבה על השקופיות, שינוי שנקרא שיטת הציפה החופשית הפך לחלופה פופולרית. טכניקה זו נכנסה לספרות בשנות ה-60-70 22,23,24, צברה פופולריות בשנות ה-80 25,26,27,28,29, וכיום היא שיטה מבוססת היטב הכוללת ביצוע הכתם על הקטעים שנאספו בהשעיה ולא היצמדה לשקופית 12,30,31 . שיטת הציפה החופשית אינה מומלצת כאשר קטעי הרקמה הם פחות מ -20 מיקרומטר; עם זאת, מניסיוננו זוהי הגישה הנבחרת כאשר חלקים עבים יותר (40-50 מיקרומטר) להיות מוכתם. יתרון מובהק אחד הוא שנוגדנים יכולים לחדור חלקים צפים חופשיים מכל הזוויות וליצור פחות צביעת רקע הודות לשטיפה יעילה יותר, כל זאת וכתוצאה מכך איתות טוב יותר בעת ההדמיה. בנוסף, החלקים מותקנים על השקופיות לאחר העיבוד, ובכך מבטלים את האפשרות של ניתוק רקמות, כמו גם מפחיתים את הזמן התופס את ההקפאה. שיטת הציפה החופשית יכולה גם להיות הרבה פחות אינטנסיבית עבודה, במיוחד עבור מחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. למשל, ניתן להכתים חלקים רבים (18-40) מאותה דגימה יחד באותה באר, מה שחוסך זמן בביצוע שלבי השטיפה והדגירה של הנוגדנים. יתר על כן, מכיוון שניתן להרכיב מספר גדול יותר (12-16) של מקטעים בכל שקופית באמצעות גישה זו, לעתים קרובות נוח ומהיר יותר לחוקר להציג ולצלם קטעים. יש לציין כי במהלך הרכבה של פרוסות רקמות על השקפים, ניתן לחבר ולנתק חלקים עד לקבלת הכיוון הרצוי. החוקרים גם משתמשים לעתים קרובות בריכוזים מעט נמוכים יותר של נוגדנים בשיטת הציפה החופשית, ומכיוון שהדגירות מבוצעות בצינורות מיקרוצנטריפוגות, ניתן לאסוף את הנוגדנים בקלות ולשמר אותם עם נתרן אזיד לשימוש חוזר (ראה שלב 5.1). יתרון נוסף הוא שניתן לאחסן את המקטעים ישירות ב -80 מעלות צלזיוס בצינורות מיקרוצנטריפוגות קטנות עם תמיסה קריופרוטקגנטית32, ובכך למזער את שטח האחסון ולמקסם את תוחלת החיים של הדגימות33. החיסרון בשימוש בטכניקה זו הוא שהקטעים מטופלים הרבה, ולכן הם נוטים לפגוע. עם זאת, ניתן להקל על כך על ידי שימוש בטלטול נמוך ובמהירויות סיבוב נמוכות, כמו גם הכשרה נכונה של החוקרים כיצד להעביר את הדגימות ולהרכיב את המקטעים על השקפים.
יחד, IHC הוא כלי מבוסס וחיוני להדמיה וללוקליזציה של ביטוי חלבונים הן בתחום המחקר הקליני והן בתחום המחקר הביו-רפואי. IHC צף חופשי היא שיטה יעילה, גמישה, כמו גם כלכלית, במיוחד בעת ביצוע מחקרים היסטולוגיים בקנה מידה גדול. כאן, אנו מציגים פרוטוקול IHC פלואורסצנטי אמין וצף חופשי עבור הקהילה המדעית שניתן להתאים בהתאם לכתמים כרומוגניים של IHC וכתמים אחרים כגון המטוקסילין ואאוסין או צביעה סגולה קרזיל.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide boxes</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td>24 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular staining dish</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>70312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round artist paintbrush #2</td>
			<td>Princeton Select Series</td>
			<td>3750R</td>
			<td>Brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen matrix for embedding</td>
			<td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain tray &#8211; slide staining system</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71396-B</td>
			<td>Use dark lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Non-hardening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 12-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 6-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>WHA1440042</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לדמיין מבני רקמות ספציפיים, כמו גם ביטוי חלבונים ולוקליזציה. שתי גישות חלופיות נמצאות בשימוש נרחב לטיפול בקטעי הרקמה במהלך הליך הצביעה, גישה אחת כוללת הרכבה ישירה של החלקים על שקופיות זכוכית, ואילו גישה שנייה, הציפה החופשית, מאפשרת לשמור על חלקים קבועים ולהכתים אותם כשהם תלויים בתמיסה. למרות שגישות המותקנות על שקופיות וצפות חופשיות עשויות להניב תוצאות דומות, טכניקת הציפה החופשית מאפשרת חדירת נוגדנים טובה יותר ולכן צריכה להיות השיטה המועדפת כאשר חלקים עבים יותר ישמשו לשחזור תלת-ממדי של הרקמות, למשל כאשר מוקד הניסוי הוא להשיג מידע על הקרנות דנדריטיות ואקסונליות באזורי מוח. בנוסף, מכיוון שהסעיפים נשמרים בתמיסה, אליציטוט יחיד יכול להכיל בקלות 30 עד 40 חלקים, שהטיפול בהם פחות מייגע, במיוחד במחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. במאמר זה נמחיש כיצד ליישם את שיטת הציפה החופשית על צביעה פלואורסצנטית של אימונוהיסטוכימיה, תוך התמקדות בעיקר במקטעי מוח. נדון גם כיצד ניתן לשנות בקלות את טכניקת הציפה החופשית כך שתתאים לצרכים האישיים של החוקרים ותותאם לרקמות אחרות, כמו גם לכתמים היסטוכימיים אחרים, כגון המטוקסילין ואאוזין וקרסיל סגול, כל עוד דגימות הרקמה קבועות כראוי, בדרך כלל עם פרפורמלדהיד או פורמלין.

התוכנית הכוללת של השימוש בשיטת הציפה החופשית לביצוע בדיקה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מודגמת באיור 1. דוגמה מייצגת של IHC פלואורסצנטי המשתמש בשיטת הציפה החופשית במוח עכבר הבוחן ביטוי חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) מוצגת באיור 2 בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections at JoVE.com

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

This free floating technique can be used to perform for lessened immunohistochemistry on mouse brain tissue samples. The free floating technique provides several advantages. The acquisition of thicker tissue sections, the performance of large scale studies, using 30 to 40 slices per aliquot and the long-term storage of samples.If you are trying this technique for the first time, we recommend you practice mounting sections that are not critical to your experiment to obtain experience with the method. At least one to two hours before sectioning, acclimatize the samples of interest in the cryostat at the appropriate tissue cutting temperature. When the tissues are ready.use the cryostat to acquire 20 to 50 micron thick sections and place the sections into individual inserts in PBS filled wells of a six or 12 well plate. When all of the sections have been acquired, cover the samples with approximately six milliliters per wash for three five minute washes before transferring each well of sections into two milliliter micro centrifuge tubes, containing one to 1.5 milliliters of storage solution per tube. Then store the samples at minus 80 degrees Celsius until staining.For tissue section staining, equilibrate the samples to room temperature for 10 to 20 minutes before decanting the sections into inserts in a new six well plate. When all of the storage solution has been drained, move the inserts into new wells, containing approximately six milliliters of TBS per well for three washes for five minutes with fresh TBS per wash on an orbital shaker at low speed at room temperature. After the last wash, add seven milliliters of freshly prepared blocking permeabilizing solution to each well for a 30 minute incubation on the shaker at room temperature.At the end of the incubation, add one milliliter of the primary antibody solution of interest to one two milliliter micro centrifuge tube per insert and transfer all of the sections in each insert into the appropriate two milliliter tube. Then place the tubes on a rotating mixer. Add about seven revolutions per minute for an overnight incubation at four degrees Celsius.The next morning, decant the sections from each tube into individual well inserts in a new six well plate and wash the sections two times for 30 seconds per wash and one time for 10 minutes in fresh TBS per wash. After the last wash, transfer the groups of sections into individual two milliliter micro centrifuge tubes, containing one milliliter of the appropriate secondary antibody solution per tube and incubate the samples for two hours at room temperature on an orbital shaker at low speed, protected from light. At the end of the incubation, decant the sections into inserts in a new six well plate and wash the samples two times for 30 seconds and one time for 15 minutes in fresh TBS per wash, protected from light.After the last wash, decant the sections into a glass rectangular histological chamber, three quarters filled with TBS and submerge a glass slide in the TBS. Using a fine paintbrush and a magnifying lamp if desired, carefully coax the sections toward the slide and gently tap a section onto the slide, making sure there are no wrinkles or folds. When all of the sections have been captured onto a slide, allow the slides to dry for about 10 to 15 minutes at room temperature, protected from light, until the sections are opaque and apply an appropriate aqueous mounting medium to the sections.Use tweezers to place a cover slip onto the medium and use a piece of filter paper to firmly press down on the cover slip to remove any excess medium. The sections can then be imaged, using an appropriate microscope or stored in a dark slide box set four degree Celsius. As observed in these representative images, fluorescent immunohistochemical analysis, using the free floating method can be performed on mouse brain tissue sections to examine glial fibrillar acidic protein expression.This approach is also appropriate for revealing low expression proteins, such as GFP, in a low expressing transgenic mouse brain sample or in non fluorescent histochemical staining protocols, such as cresyl violet. Other peripheral tissues are also amenable to use of this technique with no modifications required as observed for these low level GFP expressing liver tissue samples. The most important thing to remember with the free floating technique is to be gentle with the sections, especially during transfers and when the samples are on the shakers or rotators.In addition to a immunofluorescence staining, this method can be easily modified for other histochemical stains such as hematoxylin and eosin and cresyl violet or for chromogen immunohistochemistry.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

השימוש נוגדנים Anti-פוספו-girdin להמחיש אניץ מעיים בתאי עכבר לתרשים מעי צם Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...