Name: histological-based stainings using free-floating tissue sections
Uploaded: 2020-08-25T14:30:00
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우리는 국립 노화 연구소 (K99 / R00 AG055683에서 JMR), George and Anne Ryan 신경 과학 연구소 (EP, GC, JMR), 로드 아일랜드 대학의 약학 대학 (EP, GC, JMR) 및 Konung Gustaf V : s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR)를 인정하고 싶습니다. 하버드 의과 대학 유전학과의 Susan Dymecki 교수와 함께 훈련 한 박사 과정 학생 Rebecca Senft에게 자유 부동 방법을 소개 해 주셔서 감사합니다. 그림 1에 사용된 일부 이미지는 마우스 및 마이크로 원심분리기 튜브(Pixabay), 마우스 뇌(Jonas Töle, 위키미디어 공용), 저온 유지 장치 및 마우스 뇌 섹션(DataBase Center for Life Science, 위키미디어 커먼즈), 유리 용기(OpenClipart, FreeSvg.org) 및 현미경(Theresa Knott, Open Clip Art Library)과 같은 "상업적으로도 자유롭게 사용, 공유 또는 수정할 수 있는" 출처에서 얻은 것입니다.

1. 냉동 절제를위한 조직 준비
<ol><li>적절한 매립 몰드(재료 표 참조)에 고정 조직을 삽입하여 적절한 표본 매트릭스(재료 표 참조)를 사용하여 표본 블록을 만들고 드라이아이스에서 얼립니다. 절단할 준비가 될 때까지 시편 블록을 -80°C에서 보관하십시오. 참고: 고정 조직은 일반적으로 사용 가능한 윤리적 허가에 따라 성인(약 2.5 – 30개월) 수컷 또는 암컷 설치류(마...

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	<li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV:+Techniques+in+Experimental+Pathology.">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group.">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies:+indispensable+tools+for+biomedical+research.">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li><li>Taylor, S. N., Harlow, E. D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Antibodies:+A+Laboratory+Manual.">Using Antibodies: A Laboratory Manual.</a> The Quarterly Review of Biology. 74 (3), 374 (1999).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Hermersd&#246;rfer, H., Beesley, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunocytochemistry. A Practical Approach. 38 (3), 348-348 (1994).</li><li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+Immunohistochemistry.">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Review+of+Cytology.">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li><li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections.">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry.">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).</li><li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, 43-55 (2020).</li><li>H&#246;kfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues.">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons.">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin.">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li><li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focus+on+fixation.">A focus on fixation.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li><li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry.">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections.">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fos:+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections.">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li><li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides.">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li><li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation.">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li><li>Desmet, V. J., Krstulovi&#263;, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+(ANIT)+induced+cholestasis.">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li><li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat.">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li><li>L&#246;nnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney.">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li><li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+(GnRH)+and+Pro-GnRH,+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain.">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li><li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue.">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li><li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity.">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li><li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain:+a+light+and+electron+microscopic+study.">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li><li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum.">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li><li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury:+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers.">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li><li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo.">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li><li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology.">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li><li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry.">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry.">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li><li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papel+da+imuno-histoqu&#237;mica+no+diagn&#243;stico+do+c&#226;ncer+de+pulm&#227;o.">Papel da imuno-histoqu&#237;mica no diagn&#243;stico do c&#226;ncer de pulm&#227;o.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).</li><li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures.">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).</li><li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , 207-262 (1981).</li><li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cresyl+violet:+A+red+fluorescent+Nissl+stain.">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li></ol>

면역조직화학(IHC)은 조직 절편 내에서 단백질 발현 및 국소화를 식별하는 데 중요한 역할을 하는 다목적 기술입니다. 이 분석은 질병 상태에 대한 정상 기능 단계에 걸쳐 조직의 특성을 더 깊이 이해하기 위해 과학계 전체에서 사용됩니다. IHC는 암과 같은 질병의 임상 진단에서 전임상 연구10,36의 초기 발견에 이르기까지 다양한 분야에 걸쳐 사용됩니다...

면역 염색은 130 년 전 1890 년 Von Behring1에 의해 혈청 항체가 발견되면서 시작된 인기있는 연구 관행입니다. 20세기 초에는 반응1을 정량화하고 시각화하는 방법으로 항원에 염료가 부착되었고 나중에는 항체에 부착되었으며, 1941년 Albert Coons는 광학 현미경 2,3에 혁명을 일으킨 최초의 형광 항체 라벨을 개발했습니다. 용어 "면역염색"은 웨스턴 블롯, 유세포분석, ELISA, 면역세포화학, 및 면역조직화학3,4를 포함하여, 이 원리를 사용하여 개발된 많은 기술을 포함한다. 웨스턴 블롯은 조직 또는 세포 추출물에서 특정 단백질의 존재를 감지합니다5. 단백질은 겔 전기 영동을 사용하여 크기별로 분리되고, 막으로 옮겨지고, 항체를 사용하여 프로빙됩니다. 이 기술은 단백질의 존재와 단백질의 양을 나타냅니다. 그러나 세포 나 조직 내에서 단백질의 국소화에 대한 정보는 밝히지 않습니다. 또 다른 방법인 면역세포화학(ICC)은 세포 내의 단백질, 일반적으로 시험관 내에서 배양된 세포를 표지합니다. ICC는 세포 구획 내에서 단백질 발현과 국소화를 모두 보여줍니다6. 조직 수준에서 특정 단백질을 검출하고 시각화하기 위해 면역 조직 화학 (IHC)이 사용됩니다.
IHC는 연구자들이 면역계의 화학적 특성을 이용하여 조직 내의 특정 항원을 표적으로 삼는 데 사용하는 방법입니다 7,8. 효소 또는 형광 염료에 연결된 특정 1차 및 2차 항체를 생성함으로써 관심 항원을 표지하고 대부분의 조직에서 밝힐 수 있습니다(Mepham 및 Britten에서 검토됨)9. 용어 "면역조직화학" 자체는 관심있는 항원을 밝히기 위해 사용되는 표지 방법을 특정하지 않는다; 따라서이 용어는 종종 표지 방법을 명확하게 묘사하기 위해 검출 기술과 결합됩니다 : 2 차 항체가 퍼 옥시다아제와 같은 효소에 접합 될 때를 나타내는 발색 면역 조직 화학 (CIH); 또는 2차 항체가 형광단에 접합되는 경우를 나타내기 위해 형광 IHC, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 또는 테트라메틸로다민 (TRITC). IHC의 선택성을 통해 임상의와 연구원은 다양한 건강 및 질병 상태에 걸쳐 조직 전반에 걸쳐 단백질 발현 및 분포를 시각화할 수 있습니다10. 임상 영역에서 IHC는 일반적으로 암을 진단하고 다양한 유형의 암의 차이를 결정하는 데 사용됩니다. IHC는 또한 B형 간염 또는C11형 간염과 같은 신체 내 다양한 유형의 미생물 감염을 확인하는 데 사용되었습니다. 생물 의학 연구에서 IHC는 종종 조직에서 단백질 발현을 매핑하는 데 사용되며 질병 상태에서 보이는 비정상적인 단백질을 식별하는 데 중요합니다. 예를 들어, 신경 퇴행은 종종 알츠하이머 병의 Αβ 플라크 및 신경 섬유 엉킴과 같은 뇌의 비정상적인 단백질 축적을 동반합니다. 동물 모델은 종종 이러한 병리학 적 상태를 모방하기 위해 개발되며, IHC는 연구자가 관심있는 단백질을 찾고 정량화하기 위해 사용하는 한 가지 방법입니다10,12,13. 차례로, 우리는 이러한 질병의 원인과 그로 인해 발생하는 합병증에 대해 더 많이 배울 수 있습니다.
IHC 수행에는 많은 단계가 포함됩니다. 먼저, 관심있는 조직을 수집하고 염색을 준비합니다. 틀림없이 대부분의 연구자들은 고정 조직 샘플을 준비하며, 순환계를 통한 고정 제의 관류는 형태를 보존하기 때문에 최적입니다14,15. 조직 샘플의 사후 고정도 사용할 수 있지만 이상적인 결과보다 적을 수 있습니다16. 가교 고정제, 예를 들어 포름알데히드는 조직 내의 단백질 사이에 화학 결합을 생성함으로써 작용한다(17). 그런 다음 고정 조직은 마이크로톰을 사용하여 매우 얇은 층 또는 섹션으로 절단되며 많은 연구자들은 저온 유지 장치를 사용하여 냉동 섹션을 수집하는 것을 선호합니다. 거기에서 조직을 수집하여 현미경 슬라이드에 직접 장착하거나(슬라이드 장착 방법) 인산염 완충 식염수(PBS)18과 같은 용액에 현탁합니다(자유 부유 방법). 사용 된 수집 방법은 연구자의 요구에 따라 미리 결정되며,이 두 가지 방법 각각은 고유 한 장점과 단점을 나타냅니다.
슬라이드 장착 방법이 가장 일반적으로 사용되며, 예를 들어 단백질-단백질 상호 작용을 조사하는 데 중요한 매우 얇은 섹션(10-14μm)을 준비할 수 있다는 중요한 이점이 있습니다. 또한 시편의 취급이 최소한이며, 이는 조직(19)의 구조적 완전성에 대한 잠재적 손상을 감소시킨다. 연구원들은 종종 신선한 냉동 조직(드라이아이스, 이소펜탄 등을 사용하여 즉시 냉동되는 조직)에 이 기술을 사용하는데, 이는 고정 조직에 비해 매우 섬세하며 샘플의 해동을 방지하기 위해 많은 주의를 기울여야 합니다. 슬라이드 장착 섹션을 사용하는 또 다른 이점은 염색을 위한 많은 양의 용액이 일반적으로 필요하지 않다는 것입니다4. 따라서 연구자들은 소량의 값 비싼 항체 또는 기타 화학 물질을 사용하여 염색을 완료 할 수 있습니다. 또한 여러 실험 그룹의 섹션을 동일한 슬라이드에 장착할 수 있으며, 이는 특히 이미지 획득 중에 유리할 수 있습니다. 다른 한편으로, 슬라이드 장착 섹션을 사용하는 데에는 몇 가지 단점이 있는데, 가장 두드러지게 조직 섹션이 슬라이드에 부착되어 섹션의 한쪽으로 항체 침투를 제한하여 섹션의 섹션 두께 및 3D 표현을 제한한다는 것입니다. 또한 세척 중에 조직의 가장자리와 전체 섹션이 슬라이드에서 분리되어 전체 실험이 쓸모 없게 될 수 있습니다. 더욱이, IHC는 전형적으로 -20 또는 -80°C에서 저장되고, 종종 커버슬립되어 수평으로 또는 슬라이드 박스에 저장되는 항원 에피토프(20,21)의 분해를 피하기 위해 슬라이드-장착 접근법을 사용할 때 비교적 신속하게 수행되어야 하며, 이는 상대적으로 큰 저장 풋프린트를 초래한다. 마지막으로, 슬라이드 장착 기술은 연구자가 많은 수의 조직 섹션을 처리하기 위해 많은 수의 슬라이드를 처리해야 하는 경우에도 시간이 많이 소요될 수 있습니다.
슬라이드 장착 방법을 사용하는 이러한 문제 중 일부로 인해 자유 부동 방법이라는 수정이 인기 있는 대안이 되었습니다. 이 기술은 1960-70 년대 22,23,24 년에 문헌에 등장하여 1980 년대 25,26,27,28,29에서 인기를 얻었으며 이제는 슬라이드 12,30,31에 부착되지 않고 현탁액으로 수집 된 섹션에 염색을 수행하는 잘 확립 된 방법입니다. . 자유 부동 방법은 조직 절편이 20μm 미만인 경우 권장되지 않습니다. 그러나 우리의 경험상 더 두꺼운 (40-50 μm) 섹션을 염색 할 때 선택하는 접근 방식입니다. 한 가지 뚜렷한 이점은 항체가 모든 각도에서 자유 부유 섹션을 관통하고 보다 효과적인 세척으로 인해 배경 염색을 덜 생성할 수 있어 이미징 시 더 나은 신호 전달을 얻을 수 있다는 것입니다. 또한 가공 후 섹션이 슬라이드에 장착되므로 조직 분리 가능성을 제거하고 저온 유지 장치를 차지하는 시간을 줄일 수 있습니다. 자유 부동 방법은 특히 대규모 생물 의학 연구의 경우 노동 집약적 인 경우가 훨씬 적습니다. 예를 들어, 동일한 웰에서 동일한 샘플의 많은(18-40) 섹션을 함께 염색할 수 있으므로 세척 및 항체 배양 단계를 모두 수행하는 데 시간을 절약할 수 있습니다. 더욱이, 이 접근법을 사용하여 슬라이드당 더 많은 수(12-16)의 섹션을 장착할 수 있기 때문에, 연구자가 섹션을 보고 이미지화하는 것이 더 편리하고 빠른 경우가 많다. 특히, 슬라이드에 조직 슬라이스를 장착하는 동안 원하는 방향이 얻어질 때까지 섹션을 부착 및 분리할 수 있습니다. 연구원들은 또한 자유 부유 방법을 사용하여 약간 더 낮은 농도의 항체를 사용하는 경우가 많으며, 배양이 미세 원심 분리 튜브에서 수행되기 때문에 항체를 쉽게 수집하고 재사용을 위해 아지드 화 나트륨으로 보존 할 수 있습니다 (5.1 단계 참조). 또 다른 장점은 절편을 -80°C에서 동결방지제 용액(32)을 갖는 작은 미세원심분리 튜브에 직접 저장할 수 있어 저장 공간을 최소화하고 샘플(33)의 수명을 최대화할 수 있다는 것이다. 이 기술을 사용할 때의 단점은 섹션이 많이 처리되어 손상되기 쉽다는 것입니다. 그러나 이는 낮은 흔들림과 회전 속도를 사용하고 연구자에게 샘플을 옮기고 섹션을 슬라이드에 장착하는 방법을 적절하게 교육함으로써 완화할 수 있습니다.
종합하면, IHC는 임상 및 생물 의학 연구 분야 모두에서 단백질 발현을 시각화하고 국소화하기위한 확립 된 필수 도구입니다. 자유 부동 IHC는 특히 대규모 조직학 연구를 수행할 때 효율적이고 유연하며 경제적인 방법입니다. 여기에서는 발색 IHC 및 헤마톡실린 및 에오신 또는 크레실 바이올렛 염색과 같은 기타 염색에 적절하게 적용할 수 있는 과학계를 위한 신뢰할 수 있는 자유 부동 형광 IHC 프로토콜을 제시합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide boxes</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td>24 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular staining dish</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>70312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round artist paintbrush #2</td>
			<td>Princeton Select Series</td>
			<td>3750R</td>
			<td>Brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen matrix for embedding</td>
			<td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain tray &#8211; slide staining system</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71396-B</td>
			<td>Use dark lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Non-hardening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 12-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 6-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>WHA1440042</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

면역조직화학은 특정 조직 구조와 단백질 발현 및 국소화를 시각화하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 염색 절차 동안 조직 섹션을 처리하기 위해 두 가지 대체 접근법이 널리 사용되며, 한 가지 접근법은 유리 슬라이드에 직접 섹션을 장착하는 것으로 구성되며, 두 번째 접근 방식 인 자유 부유는 용액에 현탁 된 동안 고정 된 섹션을 유지하고 염색 할 수 있습니다. 슬라이드 장착 및 자유 부동 접근법은 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 자유 부유 기술은 더 나은 항체 침투를 허용하므로 실험의 초점이 뇌 영역의 수지상 및 축삭 투영에 대한 정보를 얻는 것과 같이 조직의 3D 재구성에 더 두꺼운 섹션을 사용해야 할 때 선택 방법이어야 합니다. 또한, 섹션이 용액에 보관되기 때문에, 단일 부분 표본은 30 내지 40 개의 섹션을 쉽게 수용 할 수 있으며, 특히 대규모 생물 의학 연구에서 취급이 덜 힘들다. 여기에서는 뇌 절편에 중점을 둔 형광 면역조직화학 염색에 자유 부유 방법을 적용하는 방법을 설명합니다. 또한 조직 샘플이 일반적으로 파라포름알데히드 또는 포르말린으로 적절하게 고정되는 한 자유 부동 기술을 연구자의 개별 요구에 맞게 쉽게 수정하고 헤마톡실린, 에오신 및 크레실 바이올렛과 같은 다른 조직화학 기반 염색뿐만 아니라 다른 조직에 적용할 수 있는 방법에 대해서도 논의할 것입니다.

자유 부유 방법을 사용하여 형광 면역조직화학 분석을 수행하는 전체 도식이 도 1에 예시되어 있다. 마우스 뇌에서 자유 부유법을 이용한 형광 IHC의 대표적인 예는 신경교섬유산성 단백질(GFAP) 발현을 조사하여 염색의 전반적인 품질을 설명하기 위해 더 낮은 배율 및 높은 배율 모두에서 도 2에 나타내었다. 이 접근법은 그림 3에 ?...

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Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

자유 부동 기술을 통해 연구원들은 고정된 조직 절편에서 면역조직화학을 포함한 조직학적 기반 염색을 수행하여 생물학적 구조, 세포 유형, 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있습니다. 이것은 뇌, 심장 및 간과 같은 여러 조직을 조사하는 데 유용할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 조직화학 기술입니다.

자유 부유 조직 절편을 사용한 조직학적 기반 염색

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

This free floating technique can be used to perform for lessened immunohistochemistry on mouse brain tissue samples. The free floating technique provides several advantages. The acquisition of thicker tissue sections, the performance of large scale studies, using 30 to 40 slices per aliquot and the long-term storage of samples.If you are trying this technique for the first time, we recommend you practice mounting sections that are not critical to your experiment to obtain experience with the method. At least one to two hours before sectioning, acclimatize the samples of interest in the cryostat at the appropriate tissue cutting temperature. When the tissues are ready.use the cryostat to acquire 20 to 50 micron thick sections and place the sections into individual inserts in PBS filled wells of a six or 12 well plate. When all of the sections have been acquired, cover the samples with approximately six milliliters per wash for three five minute washes before transferring each well of sections into two milliliter micro centrifuge tubes, containing one to 1.5 milliliters of storage solution per tube. Then store the samples at minus 80 degrees Celsius until staining.For tissue section staining, equilibrate the samples to room temperature for 10 to 20 minutes before decanting the sections into inserts in a new six well plate. When all of the storage solution has been drained, move the inserts into new wells, containing approximately six milliliters of TBS per well for three washes for five minutes with fresh TBS per wash on an orbital shaker at low speed at room temperature. After the last wash, add seven milliliters of freshly prepared blocking permeabilizing solution to each well for a 30 minute incubation on the shaker at room temperature.At the end of the incubation, add one milliliter of the primary antibody solution of interest to one two milliliter micro centrifuge tube per insert and transfer all of the sections in each insert into the appropriate two milliliter tube. Then place the tubes on a rotating mixer. Add about seven revolutions per minute for an overnight incubation at four degrees Celsius.The next morning, decant the sections from each tube into individual well inserts in a new six well plate and wash the sections two times for 30 seconds per wash and one time for 10 minutes in fresh TBS per wash. After the last wash, transfer the groups of sections into individual two milliliter micro centrifuge tubes, containing one milliliter of the appropriate secondary antibody solution per tube and incubate the samples for two hours at room temperature on an orbital shaker at low speed, protected from light. At the end of the incubation, decant the sections into inserts in a new six well plate and wash the samples two times for 30 seconds and one time for 15 minutes in fresh TBS per wash, protected from light.After the last wash, decant the sections into a glass rectangular histological chamber, three quarters filled with TBS and submerge a glass slide in the TBS. Using a fine paintbrush and a magnifying lamp if desired, carefully coax the sections toward the slide and gently tap a section onto the slide, making sure there are no wrinkles or folds. When all of the sections have been captured onto a slide, allow the slides to dry for about 10 to 15 minutes at room temperature, protected from light, until the sections are opaque and apply an appropriate aqueous mounting medium to the sections.Use tweezers to place a cover slip onto the medium and use a piece of filter paper to firmly press down on the cover slip to remove any excess medium. The sections can then be imaged, using an appropriate microscope or stored in a dark slide box set four degree Celsius. As observed in these representative images, fluorescent immunohistochemical analysis, using the free floating method can be performed on mouse brain tissue sections to examine glial fibrillar acidic protein expression.This approach is also appropriate for revealing low expression proteins, such as GFP, in a low expressing transgenic mouse brain sample or in non fluorescent histochemical staining protocols, such as cresyl violet. Other peripheral tissues are also amenable to use of this technique with no modifications required as observed for these low level GFP expressing liver tissue samples. The most important thing to remember with the free floating technique is to be gentle with the sections, especially during transfers and when the samples are on the shakers or rotators.In addition to a immunofluorescence staining, this method can be easily modified for other histochemical stains such as hematoxylin and eosin and cresyl violet or for chromogen immunohistochemistry.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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형광 항체를 사용하여 마우스 표피의 파라핀 섹션에 Immunohistochemistry

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