Name: histological-based stainings using free-floating tissue sections
Uploaded: 2020-08-25T14:30:00
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Nos gustaría reconocer al Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (K99 / R00 AG055683 a JMR), el Instituto George y Anne Ryan de Neurociencia (EP, GC, JMR), la Facultad de Farmacia de la Universidad de Rhode Island (EP, GC, JMR) y Konung Gustaf V: s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Agradecemos a la estudiante de doctorado Rebecca Senft, que se formó con la profesora Susan Dymecki, del Departamento de Genética de la Escuela de Medicina de Harvard, por presentarnos el método de flotación libre. Algunas imágenes utilizadas en la Figura 1 se obtuvieron de fuentes "gratuitas de usar, compartir o modificar, incluso comercialmente": tubo de ratón y microcentrífuga (Pixabay), cerebro de ratón (Jonas Töle, Wikimedia Commons), sección de criostato y cerebro de ratón (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), recipiente de vidrio (OpenClipart, FreeSvg.org) y microscopio (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Preparación del tejido para criosección
<ol><li>Incruste tejidos fijos en un molde de incrustación apropiado (consulte la Tabla de materiales) para crear un bloque de muestra utilizando una matriz de muestra apropiada (consulte la Tabla de materiales) y congele en hielo seco. Almacene los bloques de muestras a -80 °C hasta que estén listos para seccionar. NOTA: Los tejidos fijos se preparan típicamente perfundiendo roedores machos o hembras adultos (aprox. 2,5 – 30 meses ...

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La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica versátil que se ha vuelto crucial para identificar la expresión y localización de proteínas dentro de las secciones de tejido. Este ensayo se utiliza en toda la comunidad científica para comprender mejor las características del tejido a través de las etapas de la función normal a los estados de enfermedad. La IHQ se emplea en una variedad de campos, desde el diagnóstico clínico de enfermedades como el cáncer hasta los descubrimientos iniciales en la investigación p...

La inmunotinción es una práctica de investigación popular que comenzó hace 130 años con el descubrimiento de los anticuerpos séricos en 1890 por Von Behring1. A principios delsiglo XX, los colorantes se unieron a antígenos y más tarde a anticuerpos como una forma de cuantificar y visualizar reacciones1, y en 1941 Albert Coons desarrolló las primeras etiquetas de anticuerpos fluorescentes, un descubrimiento que revolucionó la microscopía de luz 2,3. El término "inmunotinción" abarca muchas técnicas que han sido desarrolladas utilizando este principio, incluyendo Western blot, citometría de flujo, ELISA, inmunocitoquímica e inmunohistoquímica 3,4. Western blot detecta la presencia de proteínas específicas de extractos de tejidos o células5. Las proteínas se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, se transfieren a una membrana y se sondean con anticuerpos. Esta técnica indica la presencia de proteína y cuánta proteína está presente; Sin embargo, no revela ninguna información sobre la localización de la proteína dentro de las células o tejidos. Otro método, la inmunocitoquímica (ICC), marca proteínas dentro de las células, típicamente células cultivadas in vitro. ICC muestra tanto la expresión de proteínas como la localización dentro de los compartimentos celulares6. Para detectar y visualizar una proteína específica a nivel tisular, se utiliza la inmunohistoquímica (IHC).
La IHQ es un método que los investigadores utilizan para atacar antígenos específicos dentro del tejido, aprovechando las propiedades químicas del sistema inmune 7,8. Al generar anticuerpos primarios y secundarios específicos vinculados a una enzima o a un colorante fluorescente, los antígenos de interés pueden ser marcados y revelados en la mayoría de los tejidos (como se revisó en Mepham y Britten)9. El término "inmunohistoquímica" por sí mismo no especifica el método de etiquetado que se utiliza para revelar el antígeno de interés; por lo tanto, esta terminología a menudo se combina con la técnica de detección para delinear claramente el método de etiquetado: inmunohistoquímica cromogénica (CIH) para indicar cuándo el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima, como la peroxidasa; o IHQ fluorescente para indicar cuándo el anticuerpo secundario se conjuga con un fluoróforo, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o la tetrametilrodamina (TRITC). La selectividad de IHQ permite a los médicos e investigadores visualizar la expresión y distribución de proteínas a través de los tejidos, a través de varios estados de salud y enfermedad10. En el ámbito clínico, la IHQ se usa comúnmente para diagnosticar el cáncer, así como para determinar las diferencias en varios tipos de cáncer. IHQ también se ha utilizado para confirmar diferentes tipos de infecciones microbianas dentro del cuerpo, como la hepatitis B o C11. En la investigación biomédica, la IHQ se utiliza a menudo para mapear la expresión de proteínas en los tejidos y es importante para identificar proteínas anormales observadas en estados de enfermedad. Por ejemplo, la neurodegeneración a menudo se acompaña de la acumulación de proteínas anormales en el cerebro, como placas Αβ y ovillos neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer. Los modelos animales a menudo se desarrollan para imitar estos estados patológicos, y la IHQ es un método que los investigadores utilizan para localizar y cuantificar las proteínas de interés10,12,13. A su vez, podemos aprender más sobre las causas de estas enfermedades y las complicaciones que surgen con ellas.
Hay muchos pasos involucrados en la realización de IHC. Primero, el tejido de interés se recolecta y se prepara para la tinción. Podría decirse que la mayoría de los investigadores preparan muestras de tejido fijas, siendo óptima la perfusión del fijador a través del sistema circulatorio ya que preserva la morfología14,15. También se puede utilizar la fijación posterior de muestras de tejido, pero puede producir resultados inferiores a los ideales16. Los fijadores de reticulación, como el formaldehído, actúan creando enlaces químicos entre las proteínas en el tejido17. Luego, el tejido fijo se corta en capas o secciones muy delgadas con un micrótomo, y muchos investigadores prefieren recolectar secciones congeladas con un criostato. A partir de ahí, el tejido se recoge y se monta directamente en un portaobjetos de microscopio (método montado en portaobjetos) o se suspende en una solución (método de flotación libre), como la solución salina tamponada con fosfato (PBS)18. El método de recolección utilizado está predeterminado en función de las necesidades del investigador, y cada uno de estos dos métodos presenta sus propias ventajas y desventajas.
El método montado en portaobjetos es, con mucho, el más utilizado, con un beneficio importante que es que se pueden preparar secciones muy delgadas (10-14 μm), lo cual es importante, por ejemplo, para investigar las interacciones proteína-proteína. También hay un manejo mínimo de la muestra, lo que disminuye el daño potencial a la integridad estructural del tejido19. Los investigadores a menudo usan esta técnica con tejido fresco congelado (tejido que se congela inmediatamente con hielo seco, isopentano, etc.), que es muy delicado en comparación con el tejido fijo y se debe tener mucho cuidado para evitar la descongelación de la muestra. Otra ventaja del uso de secciones montadas en guías es que generalmente no se requieren grandes volúmenes de soluciones para teñir4. Por lo tanto, los investigadores pueden usar una cantidad menor de anticuerpos costosos u otros productos químicos para completar la mancha. Además, es posible montar secciones de varios grupos experimentales diferentes en la misma diapositiva, lo que puede ser ventajoso, especialmente durante la adquisición de imágenes. Por otro lado, hay algunas desventajas de usar secciones montadas en portaobjetos, sobre todo que la sección de tejido se adhiere al portaobjetos, lo que restringe la penetración de anticuerpos a un lado de la sección, lo que limita el grosor de la sección y la representación 3D del tejido. También puede suceder que durante los lavados, los bordes del tejido y secciones enteras se desprendan del portaobjetos, haciendo inútil todo el experimento. Además, la IHQ generalmente debe realizarse con relativa rapidez cuando se utiliza el enfoque montado en portaobjetos para evitar la degradación del epítopo del antígeno 20,21 con portaobjetos sin procesar almacenados típicamente a -20 o -80 °C, a menudo cubiertos y almacenados horizontalmente o en cajas portaobjetos, lo que resulta en una huella de almacenamiento relativamente grande. Por último, la técnica montada en portaobjetos también puede llevar mucho tiempo si los investigadores deben manejar un gran número de portaobjetos para procesar un gran número de secciones de tejido.
Debido a algunos de estos desafíos utilizando el método montado en deslizamiento, una modificación llamada método de flotación libre se ha convertido en una alternativa popular. Esta técnica entró en la literatura en los años 1960-70 22,23,24, ganando popularidad en la década de 1980 25,26,27,28,29, y ahora es un método bien establecido que consiste en realizar la tinción en las secciones recogidas en suspensión en lugar de adherirse a una diapositiva 12,30,31 . No se recomienda el método de flotación libre cuando las secciones de tejido son inferiores a 20 μm; Sin embargo, en nuestra experiencia, es el enfoque de elección cuando se van a teñir secciones más gruesas (40-50 μm). Un beneficio distintivo es que los anticuerpos pueden penetrar secciones flotantes desde todos los ángulos y generar menos tinción de fondo debido a un lavado más efectivo, todo lo que resulta en una mejor señalización al obtener imágenes. Además, las secciones se montan en los portaobjetos después del procesamiento, eliminando así la posibilidad de desprendimiento de tejido y disminuyendo el tiempo que ocupa el criostato. El método de flotación libre también puede ser mucho menos intensivo en mano de obra, especialmente para estudios biomédicos a gran escala. Por ejemplo, es posible teñir muchas secciones (18-40) de la misma muestra juntas en el mismo pocillo, lo que ahorra tiempo al realizar los pasos de lavado e incubación de anticuerpos. Además, dado que se puede montar un número mayor (12-16) de secciones por diapositiva utilizando este enfoque, a menudo es más conveniente y más rápido para el investigador ver e imaginar secciones. En particular, durante el montaje de rodajas de tejido en los portaobjetos, las secciones se pueden unir y separar hasta obtener la orientación deseada. Los investigadores también suelen utilizar concentraciones ligeramente más bajas de anticuerpos utilizando el método de flotación libre, y dado que las incubaciones se realizan en tubos de microcentrífuga, los anticuerpos se pueden recolectar y conservar fácilmente con azida de sodio para su reutilización (véase el Paso 5.1). Otra ventaja es que las secciones pueden almacenarse directamente a -80 °C en pequeños tubos de microcentrífuga con solución crioprotectora32, minimizando así el espacio de almacenamiento y maximizando la longevidad de las muestras33. Una desventaja de usar esta técnica es que las secciones se manejan mucho y, por lo tanto, son propensas a dañarse. Esto, sin embargo, se puede mitigar mediante el uso de bajas velocidades de agitación y rotación, así como la capacitación adecuada de los investigadores sobre cómo transferir las muestras y montar las secciones en las diapositivas.
En conjunto, IHQ es una herramienta establecida y esencial para visualizar y localizar la expresión de proteínas en los campos de investigación clínica y biomédica. La IHQ de flotación libre es un método eficiente, flexible y económico, especialmente cuando se realizan estudios histológicos a gran escala. Aquí, presentamos un protocolo confiable de IHQ fluorescente de flotación libre para la comunidad científica que se puede adaptar en consecuencia para IHC cromogénica y otras tinciones como hematoxilina y eosina o tinción de violeta de cresil.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide boxes</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td>24 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular staining dish</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>70312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round artist paintbrush #2</td>
			<td>Princeton Select Series</td>
			<td>3750R</td>
			<td>Brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen matrix for embedding</td>
			<td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain tray &#8211; slide staining system</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71396-B</td>
			<td>Use dark lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Non-hardening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 12-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 6-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>WHA1440042</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para visualizar estructuras tisulares específicas, así como la expresión y localización de proteínas. Dos enfoques alternativos son ampliamente utilizados para manejar las secciones de tejido durante el procedimiento de tinción, un enfoque consiste en montar las secciones directamente en portaobjetos de vidrio, mientras que un segundo enfoque, el de flotación libre, permite mantener y teñir secciones fijas mientras están suspendidas en solución. Aunque los enfoques montados en diapositivas y flotantes libres pueden producir resultados similares, la técnica de flotación libre permite una mejor penetración de anticuerpos y, por lo tanto, debe ser el método de elección cuando se van a utilizar secciones más gruesas para la reconstrucción 3D de los tejidos, por ejemplo, cuando el enfoque del experimento es obtener información sobre proyecciones dendríticas y axonales en regiones cerebrales. Además, dado que las secciones se mantienen en solución, una sola alícuota puede acomodar fácilmente de 30 a 40 secciones, cuyo manejo es menos laborioso, particularmente en estudios biomédicos a gran escala. Aquí, ilustramos cómo aplicar el método de flotación libre a la tinción inmunohistoquímica fluorescente, con un enfoque principal en las secciones del cerebro. También discutiremos cómo la técnica de flotación libre puede modificarse fácilmente para adaptarse a las necesidades individuales de los investigadores y adaptarse a otros tejidos, así como a otras tinciones basadas en histoquímica, como hematoxilina y eosina y violeta de cresil, siempre que las muestras de tejido se fijen correctamente, generalmente con paraformaldehído o formalina.

El esquema general del uso del método de flotación libre para realizar un ensayo inmunohistoquímico fluorescente se ilustra en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un ejemplo representativo de IHQ fluorescente utilizando el método de flotación libre en cerebro de ratón que examina la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) con un aumento menor y más alto para ilustrar la calidad general de la tinción. Este enfoque también es apropiado ...

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Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

This free floating technique can be used to perform for lessened immunohistochemistry on mouse brain tissue samples. The free floating technique provides several advantages. The acquisition of thicker tissue sections, the performance of large scale studies, using 30 to 40 slices per aliquot and the long-term storage of samples.If you are trying this technique for the first time, we recommend you practice mounting sections that are not critical to your experiment to obtain experience with the method. At least one to two hours before sectioning, acclimatize the samples of interest in the cryostat at the appropriate tissue cutting temperature. When the tissues are ready.use the cryostat to acquire 20 to 50 micron thick sections and place the sections into individual inserts in PBS filled wells of a six or 12 well plate. When all of the sections have been acquired, cover the samples with approximately six milliliters per wash for three five minute washes before transferring each well of sections into two milliliter micro centrifuge tubes, containing one to 1.5 milliliters of storage solution per tube. Then store the samples at minus 80 degrees Celsius until staining.For tissue section staining, equilibrate the samples to room temperature for 10 to 20 minutes before decanting the sections into inserts in a new six well plate. When all of the storage solution has been drained, move the inserts into new wells, containing approximately six milliliters of TBS per well for three washes for five minutes with fresh TBS per wash on an orbital shaker at low speed at room temperature. After the last wash, add seven milliliters of freshly prepared blocking permeabilizing solution to each well for a 30 minute incubation on the shaker at room temperature.At the end of the incubation, add one milliliter of the primary antibody solution of interest to one two milliliter micro centrifuge tube per insert and transfer all of the sections in each insert into the appropriate two milliliter tube. Then place the tubes on a rotating mixer. Add about seven revolutions per minute for an overnight incubation at four degrees Celsius.The next morning, decant the sections from each tube into individual well inserts in a new six well plate and wash the sections two times for 30 seconds per wash and one time for 10 minutes in fresh TBS per wash. After the last wash, transfer the groups of sections into individual two milliliter micro centrifuge tubes, containing one milliliter of the appropriate secondary antibody solution per tube and incubate the samples for two hours at room temperature on an orbital shaker at low speed, protected from light. At the end of the incubation, decant the sections into inserts in a new six well plate and wash the samples two times for 30 seconds and one time for 15 minutes in fresh TBS per wash, protected from light.After the last wash, decant the sections into a glass rectangular histological chamber, three quarters filled with TBS and submerge a glass slide in the TBS. Using a fine paintbrush and a magnifying lamp if desired, carefully coax the sections toward the slide and gently tap a section onto the slide, making sure there are no wrinkles or folds. When all of the sections have been captured onto a slide, allow the slides to dry for about 10 to 15 minutes at room temperature, protected from light, until the sections are opaque and apply an appropriate aqueous mounting medium to the sections.Use tweezers to place a cover slip onto the medium and use a piece of filter paper to firmly press down on the cover slip to remove any excess medium. The sections can then be imaged, using an appropriate microscope or stored in a dark slide box set four degree Celsius. As observed in these representative images, fluorescent immunohistochemical analysis, using the free floating method can be performed on mouse brain tissue sections to examine glial fibrillar acidic protein expression.This approach is also appropriate for revealing low expression proteins, such as GFP, in a low expressing transgenic mouse brain sample or in non fluorescent histochemical staining protocols, such as cresyl violet. Other peripheral tissues are also amenable to use of this technique with no modifications required as observed for these low level GFP expressing liver tissue samples. The most important thing to remember with the free floating technique is to be gentle with the sections, especially during transfers and when the samples are on the shakers or rotators.In addition to a immunofluorescence staining, this method can be easily modified for other histochemical stains such as hematoxylin and eosin and cresyl violet or for chromogen immunohistochemistry.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Inmunohistoquímica: las secciones de parafina utilizando la Vectastain ABC Kit de Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Investigación

Biología

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Inmunohistoquímica en secciones de parafina de la epidermis del ratón Utilizando anticuerpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genotipificación rápida de tejido de ratón utilizando extracto-N-Amp tejido Sigma PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

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Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

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Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

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