Name: in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle
Uploaded: 2020-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 og UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Æggestokkene blev indsamlet fra 4 til 8 år gamle Holstenske malkekøer genvundet på det lokale slagteri (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italien).
1. Forberedelse af medier
BEMÆRK: Alle medier skal være forberedt mindst fire timer før brug. Natriumbikarbonat-puffede medier inkuberes ved 38,5 °C og 5% CO2 i luft, maksimal luftfugtighed. HEPES-puffede medier vedligeholdes ved 38,5 °C i termostatovn.
<ol><li>Lang in vitro kul...

<ol>
	<li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Oocytes+in+Vitro.">Maturation of Oocytes in Vitro.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).</li><li>Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+communications+regulate+chromatin+remodeling+during+bovine+oocyte+growth+and+differentiation+through+cAMP-dependent+mechanism(s).">Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s).</a> Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).</li><li>McLaughlin, M., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+bovine+primordial+follicles+is+promoted+by+activin+and+FSH+within+a+two-step+serum-free+culture+system.">Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system.</a> Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).</li><li>Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achievements+and+unmet+promises+of+assisted+reproduction+technologies+in+large+animals:+a+per-sonal+perspective.">Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective.</a> Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).</li><li>Luciano, A. M., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+in+vitro+maturation+of+oocytes:+a+matter+of+follicular+differentiation.">Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation.</a> Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).</li><li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-produced+bovine+embryos:+dealing+with+the+warts.">In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts.</a> Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).</li><li>Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+reserve+of+primordial+follicles+and+the+dynamic+reserve+of+antral+growing+follicles:+what+is+the+link.">The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link.</a> Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).</li><li>Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+of+follicles+in+the+ovary+of+the+cow.">Growth rates of follicles in the ovary of the cow.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).</li><li>Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+ultrastructure+in+bovine+primordial+to+early+tertiary+follicles.">Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles.</a> Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).</li><li>Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+developmental+competence+of+bovine+oocytes+derived+from+different+categories+of+antral+follicles.">Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles.</a> Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).</li><li>Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+and+follicular+morphology+as+determining+characteristics+for+developmental+competence+in+bovine+oocytes.">Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).</li><li>Harada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+from+early+antral+follicles+grow+to+meiotic+competence+in+vitro:+effect+of+FSH+and+hypoxanthine.">Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine.</a> Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).</li><li>Hirao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+and+development+of+bovine+oocyte-granulosa+cell+complexes+on+the+flat+substratum:+effects+of+high+polyvinylpyrrolidone+concentration+in+culture+medium.">In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).</li><li>Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+meiotic+competence+of+bovine+oocytes+originating+from+early+antral+ovarian+follicles.">Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles.</a> Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).</li><li>Taketsuru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+in+secondary+follicles+grow+in+medium+containing+bovine+plasma+after+vitrification.">Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+supports+in+vitro+development+of+bovine+early+antral+follicles.">Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles.</a> Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+promote+bovine+oocyte+growth+and+connection+with+granulosa+cells.">Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells.</a> Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+to+live+young+from+bovine+small+oocytes+after+growth,+maturation+and+fertilization+in+vitro.">Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro.</a> Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).</li><li>Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PDE3A+sustains+meiotic+arrest+and+gap+junction+of+bovine+growing+oocytes+in+in+vitro+growth+culture.">Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture.</a> Theriogenology. 118, 110-118 (2018).</li><li>Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+chromatin+remodeling+in+germinal+vesicle+bovine+oocytes:+interplay+with+gap+junction+functionality+and+developmental+competence.">Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+morphology+and+transcriptional+silencing+in+relation+to+chromatin+remodeling+during+the+final+phases+of+bovine+oocyte+growth.">Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+cumulus+cell+gene+expression+indicate+the+benefit+of+a+pre-maturation+step+to+improve+in-vitro+bovine+embryo+production.">Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production.</a> Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+interact+with+natriuretic+peptide+C+to+delay+nuclear+maturation,+to+maintain+oocyte-cumulus+communication+and+to+improve+the+quality+of+in+vitro-produced+embryos+in+cattle.">Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle.</a> Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+control+of+oocyte+large-scale+chromatin+configuration+in+different+cattle+breeds.">Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds.</a> Theriogenology. 141, 146-152 (2020).</li><li>Franciosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+precursor+C+delays+meiotic+resumption+and+sustains+gap+junction-mediated+communication+in+bovine+cumulus-enclosed+oocytes.">Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes.</a> Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+levels+of+intracellular+cAMP+on+the+in+vitro+maturation+of+cattle+oocytes+and+their+subsequent+development+following+in+vitro+fertilization.">Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization.</a> Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).</li><li>Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oocyte+quality+on+development+and+transcriptional+activity+in+early+bovine+embryos.">Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos.</a> Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cilostamide+on+gap+junction+communication+dynamics,+chromatin+remodeling,+and+competence+acquisition+in+pig+oocytes+following+parthenogenetic+activation+and+nuclear+transfer.">The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer.</a> Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).</li><li>Shu, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+supports+transcription+and+improves+meiotic+competence+of+growing+bovine+oocytes.">Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes.</a> Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).</li><li>Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrophin+and+steroid+concentrations+in+bovine+follicular+fluid+and+their+relationship+to+follicle+size.">Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).</li><li>Kruip, T. A., Dieleman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+concentrations+in+the+fluid+of+bovine+follicles+relative+to+size,+quality+and+stage+of+the+oestrus+cycle.">Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle.</a> Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).</li><li>Sakaguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+antral+follicle+count,+steroidogenesis,+and+secretion+of+follicle-stimulating+hormone+and+anti-Mullerian+hormone+during+follicular+growth+in+cattle.">Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+promote+the+acquisition+of+maturation+competence+in+bovine+oocytes.">Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes.</a> Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).</li><li>Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+actions+and+the+ovary.">Androgen actions and the ovary.</a> Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).</li><li>Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+inhibits+large+granulosa+cell+apoptosis+by+stimulating+progesterone+synthesis+and+regulating+the+distribution+of+intracellular+free+calcium.">Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium.</a> Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).</li><li>Gordon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).</li><li>Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+serum-free+culture+system+supports+development+of+human+oocytes+from+primordial+follicles+in+the+presence+of+activin.">A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin.</a> Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocyte+diameter+in+relation+to+maturational+competence+and+transcriptional+activity.">Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).</li></ol>

Her beskriver vi et kultursystem til dyrkning af oocytter, der fremmer oocytudvikling i 5 dage ved at støtte deres levedygtighed og forhindre meiotisk genoptagelse. Sidstnævnte aspekt er af allerstørste betydning for at muliggøre den fortsatte vækst og differentiering, der er nødvendig for at give oocytet meiotisk og embryonisk udviklingskompetence2,20, som ellers ville blive blokeret af en for tidlig genoptagelse af meiotisk opdeling.
<p class="jove_co...

I løbet af den reproduktive levetid, kun en minimal brøkdel af oocytter, der er til stede i en æggesto, frigives i æggelederne ved ægløsning, og er til rådighed for at blive befrugtet og udvikle sig til en levedygtig embryo1. På den anden side, de fleste af de oocytter inden for en æggestor gennemgå atresi og er aldrig ægløsning. In vitro embryoproduktion (IVP) teknologier har forsøgt at øge udnyttelsen af æggestokkene reserve2,3. Hidtil har sådanne teknologier tilladt interventioner frugtbarhed bevarelse, udvælgelsesprogrammer i husdyr, og bevarelse af truede arter. Ikke desto mindre, de fleste protokoller bruger oocytter, der har stort set afsluttet vækstfasen inden for antral ovariesækken, og dermed omtales som fuldt udvokset oocytter. Hos kvæg, hvor IVP-teknologier anvendes i vid udstrækning, når fuldvoksne oocytter en endelig diameter på ca. 120 μm og indsamles fra follikler, der spænder fra 2 til 8 mm i diameter (medium antralsækler)1. Efter isolering fra folliklerne, er sådanne oocytter in vitro modnet og befrugtet. Zygoterne dyrkes derefter op til blastocyst-scenen og overføres enten til en modtager eller cryopreserved. Hos kvæg og mange andre arter er antallet af in vitro-producerede embryoner pr. ko ikke i vid udstrækning blevet bedre i de sidste 40 år på trods af ivp's potentiale. Dette skyldes til dels det begrænsede antal fuldt udvoksede oocytter,der befolker en æggesting på et givet tidspunkt , som kan hentes og underkastes standard IVP-teknikker4,5,6.
Oocytterne, der er omgivet af tidlige antralsækkler,dvs.7 Disse oocytter er dog stadig i vækstfasen og har endnu ikke nået den fuldt udvoksede fase9. Som sådan er de stadig transskriptionelt aktive, der producerer mRNA'er, der vil blive gemt til senere udviklingsmæssige trin, og har endnu ikke gennemgået alle de differentiering proces, der kræves for at give oocytter med evnen til spontant at genoptage og færdiggøre meiose jeg engang isoleret fra follikulære rum10,11. De kan derfor ikke direkte underkastes standardin vitromodningsprotokoller (IVM), men de kræver en yderligere kulturperiode, der vil gøre det muligt for dem at fuldføre vækstfasen og skelne korrekt.
Overgangen fra den voksende til den fuldt udvoksede fase, som hos kvæg opstår, når follikel udvikler sig fra den tidlige antral til medium antral fase, er et af de kritiske skridt under oocyt udvikling. Hos kvæg forsøgte flere undersøgelser at opsummere disse begivenheder in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Til dato er der imidlertid ikke udviklet pålidelige protokoller, og der er kun rapporteret om begrænset succes. Ifølge tidligere undersøgelser20udgør disse voksende oocytter en homogen population. Ud over at være transskriptionelt aktiv, deres kromatin er spredt i germinale vesicle (GV), i en konfiguration, der hedder GV02,21. Omvendt er populationen af fuldvoksne oocytter fremstillet af medium antralsækkene mere heterogen, en tilstand, der afspejles af de forskellige grader af kromatinkomprimering (GV1, GV2 og GV3), der kan observeres20. Blandt disse har tidligere data vist, at GV2 og GV3 oocytter generelt er kendetegnet ved en bedre kvalitet og højere embryonale udviklingskompetence20,21,22,23,24.
Med udgangspunkt i ovenstående observationer beskriver vi her et 5-dages langt kultursystem af oocytter (L-IVCO), der gør det muligt at differentiere oocytter isoleret som cumulus-oocytkomplekser (COC'er) fra tidlige antralsækkene. Denne kultur strategi har udviklet sig fra 10 år lange undersøgelser udført i vores laboratorium og rødder sin jord på den tidligere udviklede 24-48 timer in vitro oocyt kultur (IVCO)2,præmaturation systemer23,,25 og zink tilskud under oocyt kultur. En kombination af follikel stimulerende hormon (FSH) og en fosfordiesterase-3 (PDE3) hæmmer, i stand til at forbedre cumulus-oocytkommunikation 2, forhindre alt for tidlige meiotiske genoptagelse2, og støtte oocyt vækst2 blev brugt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:215px;">4-well dishes</td>
			<td style="width:127px;">Nunclon</td>
			<td style="width:123px;">179830</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:215px;">96-well dish</td>
			<td style="width:127px;">Becton Dickinson Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">356649</td>
			<td>BioCoat&#8482; Collagen I</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell culture water</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cilostamide</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>C7971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cysteamine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td>Camera DS-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glutamax Supplement</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gonal F</td>
			<td style="width:127px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Heparin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hepes</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Vacuum pump</td>
			<td>Cook-IVF</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Sanyo</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M3769</td>
			<td style="width:171px;">Powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2520</td>
			<td>Powder for M199-D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Corp</td>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td style="width:123px;">Eclipse E 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicilin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>360k molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Progesterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium choride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Testosterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">H1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle

Den begrænsede reserve af modne, befrugtende oocytter udgør en stor hindring for succes assisteret reproduktion hos pattedyr. I betragtning af, at i løbet af den reproduktive levetid kun omkring 1% af oocytter i en æggestenning modne og ægløsning, flere teknikker er blevet udviklet for at øge udnyttelsen af æggestokkene reserve til den voksende befolkning af ikke-ægløsning follikler. Sådanne teknologier har gjort det muligt at beskytte frugtbarhed, udvælgelsesprogrammer i husdyr og bevarelse af truede arter. Det store potentiale i æggestokkene er dog stadig stort set uudnyttet. F.eks. er der gjort forsøg på at støtte in vitro-kulturen i oocytter på specifikke udviklingsstadier, men der er endnu ikke udviklet effektive og pålidelige protokoller. Her beskriver vi et kultursystem, der gengiver de fysiologiske forhold i det tilsvarende follikulære stadium, defineret til at udvikle in vitro voksende oocytter indsamlet fra kvæg tidlige antral follikler til den fuldt udvoksede fase, svarende til medium antral follikel in vivo. En kombination af hormoner og en fosfordiesterase 3-hæmmer blev brugt til at forhindre alt for tidlige meiotiske genoptagelse og til at guide oocyt's differentiering.

Ved afslutningen af L-IVCO blev co-pillernes bruttomorfologi ændret, og 4 klasser blev identificeret på grundlag af cumuluscellernes udseende, som vist i figur 2. Baseret på de morfologiske kriterier, der almindeligvis blev vedtaget for at vælge sunde p-pc'er11,,26,27, blev klasse 1, 2 og 3 anset for sunde, mens klasse 4, som viste klare tegn på degeneration, såsom fraværet af komplette lag a...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Vi beskriver procedurerne for isolering af voksende oocytter fra ovariefoskler i de tidlige udviklingsstadier samt opsætningen af et in vitro-kultursystem, der kan understøtte vækst og differentiering op til den fuldt udvoksede fase.

In Vitro Kultur strategi for Oocytter fra Early Antral Follikel hos Kvæg

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

I denne video protokol, viser vi i detaljer, et kultursystem for dyrkning af kvæg oocytter. Systemet understøtter oocytternes levedygtighed i kulturen i op til fem dage og giver mulighed for deres differentiering. Ved hjælp af denne kultur system, oocytter indsamlet fra små antral follikler, som normalt ikke anvendes i standard protokoller for in vitro i produktionen, kan dyrkes for at øge tilgængeligheden af befrugtbare gameter.Denne udnyttelse af den bredere reserve kan give nye muligheder for genetisk bjærgning af truede arter, kvægfamilien eller af lokale racer med risiko for genetisk erosion. Til at begynde, forberede 15 milliliter grundlæggende kultur medium og supplere det i henhold til manuskript retninger. Dernæst forberede tre milliliter af bedrift medium ved at tilføje fem mikromolar cilostamid til den grundlæggende kultur medium og hæld det i en 35 millimeter petriskål.Forbered lange IVCO medium ved at supplere grundlæggende kultur medium i henhold til manuskript retninger. Tilsæt 200 mikroliter af langt IVCO medium til hver brønd af en 96-godt belagt plade. Fyld derefter de fire kanter med sterilt vand for at kompensere for fordampning og for at opretholde en passende fugtighed under kulturen.Inkuber 96-brøndpladen og holdemediet ved 38,5 grader celsius og 5 % kuldioxid med maksimal luftfugtighed. Vask æggestokkene fire gange i sterilt saltvand, opretholdes ved 26 grader celsius. Derefter aspirere alle follikler, der er mere end to millimeter i diameter, med en 18 gauge nål forbundet til en aspiration pumpe.Snøre de indsugningsægte æggestokke i et bægerglas med sterilt saltvand, der holdes ved 26 grader celsius. Placer en æggestan ad gangen på en steril PTFE skærebræt, og bruge et kirurgisk nummer 22 klinge til at skære skiver af æggestokkene cortex, der er 1,5 til to millimeter tyk, og parallelt med den store akse af orglet. Lace skiverne af æggestokkene cortex i en steril glas petriskål, med dissekere medium på en varm plade, ved 38,5 grader celsius.Lace en æggestokkene cortex skive i en 60 millimeter glas petriskål, med to til tre milliliter M199D under en dissektion mikroskop, skal du vælge follikler, der er mellem 5 og to millimeter. Identificer de sunde ikke-atretiske follikler under stereomikroskopet ved at observere morfologiske parametre, såsom et ensartet lyst gennemskinneligt udseende, omfattende vaskularisering og et almindeligt granulosalag. Mens atretiske follikler har en grå uigennemsigtig udseende, og er dårligt vaskulære, med en mørk COC indeni.Kassér atretiske follikler og behandle alle de andre. Brug den kirurgiske klinge til at fjerne æggestokkene væv omkring follikel på den ene side, indtil det er udsat. Brug derefter en 26 gauge nål til omhyggeligt at lave en slids i den eksponerede follikelvæg, som vil frigive follikulærindholdet bestående af COC, follikulær væske og klumper af celler.Identificer COC og undersøge det for cumulus integritet, zona pellucida integritet og homogenitet af cytoplasmaet. Hvis disse kriterier er opfyldt, skal du aspirere coc'en med en P20-pipette. Snør den isolerede COC i M199D cilostamid, og fortsæt isolationsproceduren i 30 minutter.Når du har valgt p-piller, som tidligere beskrevet, forberede 16 dråber med 20 mikroliter M199D cilostamid i en 60 millimeter Petri fad, og placere en sund COC i hver dråbe. Brug et omvendt mikroskop fastgjort til et kamera til at måle oocytdiameteren, bortset fra zona pellucida. Med en klar visualisering af oocyt, foretage to vinkelrette målinger, sikre, at middelværdi af de to målinger er inden for et interval på 100 til 110 mikrometer.Det kan være svært præcist at måle oocytter diameter, på grund af følgesvend cumulus celler. P-piller, der har oocytter med mindre eller større diameter, eller som ikke har en afrundet oocyt, eller dem med oocytter, der ikke kan måles, bør kasseres. Overfør de valgte p-piller i en 35 millimeter skål, der indeholder M199H-medium, og hold dem i inkubatoren ved 38,5 grader celsius og 5% kuldioxid med maksimal luftfugtighed, sørg for, at den samlede arbejdstid ikke overstiger to timer.Når udvælgelses- og indsamlingsprocedurerne er afsluttet, skal du overføre en COC til midten af hver brønd i den tidligere forberedte 96-brøndplade. Inkuber pladen i fem dage ved 38,5 grader celsius og 5% kuldioxid med maksimal luftfugtighed, genopfrist mediet hver anden dag. Hvis du vil forny mediet, skal du udskifte 100 mikroliter af gammelt medium med 100 mikroliter af frisk langt IVCO-medium, gøre dette under stereomikroskopet for at undgå at flytte p-pc'erne.I slutningen af den lange IVCO analyseres p-pc'ernes morfologi. Hvis de har en kompakt cumulus celle investering uden tegn på cumulus ekspansion, eller celle degeneration, klassificere dem som klasse et. Hvis de p-piller har en kompakt cumulus celle investering uden tegn på cumulus ekspansion eller celle degeneration, og med en eller flere antrum-lignende formationer, klassificere dem som klasse to.Klasse tre P-piller, viser flere lag af cumulus celler uden tegn på cumulus ekspansion, nogle opdelte celler i det ydre lag af cumulus celler og ingen antrum-lignende dannelse. Klassificere de fælles samarbejder som klasse fire, hvis de viser rigeligt tab af cumulusceller, der strækker sig over mere end 50 % af oocytoverfladen, samt tegn på celledegeneration og celleaffald. Ved afslutningen af lang IVCO ændres COC'ens bruttomorfologi.Og fire klasser blev identificeret baseret på udseendet af cumulus celler. I alt blev 74 oocytter i fem biologiske replikater analyseret, hvoraf 9,45% blev kasseret fra yderligere evaluering. Klasse et, to og tre blev bedømt som raske, mens klasse fire viste klare tegn på degeneration, såsom fraværet af komplette lag af cumulus celler omkring oocytterne.Disse p-piller blev anset for uegnede til at gennemgå downstream-procedurer i en prospektiv IVP-indstilling. Vurderingen af den meiotiske fase i slutningen af den lange IVCO viste, at en betydeligt højere procentdel af oocytterne forblev arresteret i den umodne fase, hvor kromatin stadig var omgivet af GV. Når kromatin kondensering inden for GV blev undersøgt som en markør for gevinst af kompetence, overgangen af kromatin konfiguration til mere kondenserede faser, nemlig GV to og GV tre, blev observeret i 59% af oocytter. En lille procentdel genoptaget meiose nå metafase et trin, eller degeneration.Disse resultater viser, at L-IVCO kultur understøtter oocyt levedygtighed, samtidig med at forhindre meiotiske genoptagelse i fem dage. Ved afslutningen af den lange IVCO kan de amerikanske og regionale co'er anvendes i downstream-procedurer for in vitro-embryoproduktion, nemlig in vitromodning, befrugtning og embryokultur. Disse trin er nødvendige for at bevise konceptet, at oocyt har erhvervet en højere udviklingskompetence.Ud over at have potentialet til at øge mængden af befrugtbare oocytter er det lange IVCO-kultursystem et værktøj for forskere, der er interesseret i at dissekere de cellulære og molekylære processer, der regulerer dannelsen af en kompetent gamet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forståelse Tidlig Organogenesis efter en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridization protokol<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic fremgangsmåde for vurdering af Dannelse af neuronal forbindelser i en co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcelle-lignende<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Eksplantater at studere Tidlig Neural Udviklingsmæssige Egenskaber<em&gt; In vitro</em&gt; Og<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolering og karakterisering af muse Antral Oocyter Baseret på nucleolar chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In vitro-kultur af Epiteliale celler fra forskellige anatomiske områder af den humane amniotiske membran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...