Name: in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle
Uploaded: 2020-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 und UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Eierstöcke wurden von 4 bis 8 Jahre alten Holsteiner Milchkühen gesammelt, die im örtlichen Schlachthof geborgen wurden (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italien).
1. Medienvorbereitung
HINWEIS: Alle Medien müssen mindestens vier Stunden vor Gebrauch vorbereitet werden. Natriumbicarbonat-gepufferte Medien werden bei 38,5 °C und 5%CO2 in der Luft, maximale Luftfeuchtigkeit, inkubiert. HEPES-gepufferte Medien werden im Thermostatofe...

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	<li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Oocytes+in+Vitro.">Maturation of Oocytes in Vitro.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).</li><li>Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+communications+regulate+chromatin+remodeling+during+bovine+oocyte+growth+and+differentiation+through+cAMP-dependent+mechanism(s).">Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s).</a> Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).</li><li>McLaughlin, M., Telfer, E. 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C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+interact+with+natriuretic+peptide+C+to+delay+nuclear+maturation,+to+maintain+oocyte-cumulus+communication+and+to+improve+the+quality+of+in+vitro-produced+embryos+in+cattle.">Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle.</a> Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+control+of+oocyte+large-scale+chromatin+configuration+in+different+cattle+breeds.">Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds.</a> Theriogenology. 141, 146-152 (2020).</li><li>Franciosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+precursor+C+delays+meiotic+resumption+and+sustains+gap+junction-mediated+communication+in+bovine+cumulus-enclosed+oocytes.">Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes.</a> Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+levels+of+intracellular+cAMP+on+the+in+vitro+maturation+of+cattle+oocytes+and+their+subsequent+development+following+in+vitro+fertilization.">Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization.</a> Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).</li><li>Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oocyte+quality+on+development+and+transcriptional+activity+in+early+bovine+embryos.">Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos.</a> Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cilostamide+on+gap+junction+communication+dynamics,+chromatin+remodeling,+and+competence+acquisition+in+pig+oocytes+following+parthenogenetic+activation+and+nuclear+transfer.">The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer.</a> Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).</li><li>Shu, Y. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocyte+diameter+in+relation+to+maturational+competence+and+transcriptional+activity.">Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein Kultursystem für wachsende Eizellen, das die Eizellenentwicklung für 5 Tage fördert, indem es ihre Lebensfähigkeit unterstützt und die meiotische Wiederaufnahme verhindert. Dieser letztgenannte Aspekt ist von größter Bedeutung, um das kontinuierliche Wachstum und die Differenzierung zu ermöglichen, die notwendig sind, um die Eizelle mit meiotischer und embryonaler Entwicklungskompetenz2,20zu verleihen, die andernfalls durch eine v...

Während der Fortpflanzungsdauer wird nur ein minimaler Bruchteil der Eizellen, die in einem Eierstock reifen, in den Eileitern nach dem Eisprung freigesetzt und zur Befruchtung zur Verfügung gestellt und zu einem lebensfähigen Embryo1entwickelt. Auf der anderen Seite, die meisten der Eizellen innerhalb eines Eierstocks unterziehen Atresie und werden nie eigewellt. In-vitro-Embryoproduktion (IVP) Technologien haben versucht, die Ausbeutung der Eierstockreserve zu erhöhen2,3. Bisher haben solche Technologien Eingriffe in die Fruchtbarkeitserhaltung, Selektionsprogramme bei Nutztieren und die Erhaltung gefährdeter Arten ermöglicht. Dennoch verwenden die meisten Protokolle Eizellen, die im Grunde die Wachstumsphase innerhalb des antralen Ovarialfollikels abgeschlossen haben, und werden daher als ausgewachsene Eizellen bezeichnet. Bei Rindern, bei denen IVP-Technologien weit verbreitet sind, erreichen ausgewachsene Eizellen einen Enddurchmesser von ca. 120 m und werden aus Follikel mit einem Durchmesser von 2 bis 8 mm (mittlere Antraline)1gesammelt. Nach Isolierung von den Follikel werden solche Eizellen in vitro gereift und befruchtet. Die Zygoten werden dann bis zum Blastozystenstadium kultiviert und entweder in einen Empfänger übertragen oder kryokonserviert. Bei Rindern wie auch bei vielen anderen Arten hat sich die Zahl der in vitro produzierten Embryonen pro Kuh in den letzten 40 Jahren trotz des Potenzials von IVP nicht wesentlich verbessert. Dies ist zum Teil auf die begrenzte Anzahl ausgewachsener Eizellen zurückzuführen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt einen Eierstock bevölkern, der abgerufen und den Standard-IVP-Techniken4,5,6unterzogen werden kann.
Die in frühen Antradenfollikel eingeschlossenen Eizellen, d.h. die Follikel mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm, stellen eine potentielle Quelle dar, die in Fruchtbarkeitserhaltungsprogrammen7 verwendet werden kann, da ein Eierstock etwa 10-mal mehr frühe Anralfollikel enthält als mittlere Antral8 .8 Diese Eizellen befinden sich jedoch noch in der Wachstumsphase und haben noch nicht die ausgewachsene Stufe9erreicht. Als solche sind sie immer noch transkriptional aktiv, produzieren mRNAs, die für spätere Entwicklungsschritte gespeichert werden, und haben noch nicht alle Differenzierungsprozess erforderlich, um die Eizellen mit der Fähigkeit der spontanen Wiederaufnahme und Vervollständigung der Meiose ich einmal isoliert aus dem Follikulärfach10,11. Daher können sie nicht direkt den Standard-In-vitro-Reifungsprotokollen (IVM) unterzogen werden, aber sie erfordern eine zusätzliche Kulturperiode, die es ihnen ermöglichen würde, die Wachstumsphase abzuschließen und richtig zu differenzieren.
Der Übergang vom Anbau zum ausgewachsenen Stadium, der bei Rindern auftritt, wenn sich der Follikel vom frühen Antrale zum mittleren antralen Stadium entwickelt, ist einer der kritischen Schritte während der Eizellenentwicklung. Bei Rindern versuchten mehrere Studien, diese Ereignisse in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19zu rekapitulieren. Bisher wurden jedoch keine zuverlässigen Protokolle entwickelt und nur begrenzter Erfolg gemeldet. Nach früheren Studien20bilden diese wachsenden Eizellen eine homogene Population. Neben der Transkriptionsaktivität wird ihr Chromatin im Keimbläschen (GV) in einer Konfiguration mit dem Namen GV02,21verteilt. Umgekehrt ist die Population ausgewachsener Eizellen, die aus mittleren Antralenfolliken gewonnen werden, heterogener, ein Zustand, der sich in den verschiedenen Graden der Chromatinverdichtung (GV1, GV2 und GV3) widerspiegelt, die beobachtet werden können20. Unter diesen haben frühere Daten gezeigt, dass GV2 und GV3 Oozyten insgesamt durch eine bessere Qualität und höhere embryonale Entwicklungskompetenz gekennzeichnet sind20,21,22,23,24.
Ausgehend von den obigen Beobachtungen beschreiben wir hier ein 5 Tage langes Kultursystem von Eizellen (L-IVCO), das die Differenzierung von Eizellen ermöglicht, die als Cumulus-Oozytenkomplexe (COCs) von frühen antralen Follikel isoliert sind. Diese Kulturstrategie hat sich aus 10 Jahren langen Studien in unserem Labor entwickelt und wurzelt ihren Grund auf der zuvor entwickelten 24-48 Stunden In-vitro-Oozytenkultur (IVCO)2, Prämaturationssysteme23,25 und Zink-Supplementierung während der Oozytenkultur . Eine Kombination aus Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und einem Phosphodiesterase-3 (PDE3)-Hemmer, der in der Lage ist, die Cumulus-Oozyten-Kommunikation zu verbessern2, eine vorzeitige meiotische Wiederaufnahme zu verhindern2, und das Oozytenwachstum2 zu unterstützen, wurde verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:215px;">4-well dishes</td>
			<td style="width:127px;">Nunclon</td>
			<td style="width:123px;">179830</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:215px;">96-well dish</td>
			<td style="width:127px;">Becton Dickinson Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">356649</td>
			<td>BioCoat&#8482; Collagen I</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell culture water</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cilostamide</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>C7971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cysteamine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td>Camera DS-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glutamax Supplement</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gonal F</td>
			<td style="width:127px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Heparin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hepes</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Vacuum pump</td>
			<td>Cook-IVF</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Sanyo</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M3769</td>
			<td style="width:171px;">Powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2520</td>
			<td>Powder for M199-D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Corp</td>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td style="width:123px;">Eclipse E 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicilin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>360k molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Progesterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium choride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Testosterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">H1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle

Die begrenzte Reserve an reifen, befruchtbaren Eizellen stellt ein großes Hindernis für den Erfolg der assistierten Fortpflanzung bei Säugetieren dar. Wenn man bedenkt, dass während der Fortpflanzungszeit nur etwa 1% der Eizellen in einem Eierstock reifen und Eizellen entwickelt wurden, wurden mehrere Techniken entwickelt, um die Ausbeutung der Eierstockreserve für die wachsende Bevölkerung von nicht-ovulatorischen Follikel zu erhöhen. Solche Technologien haben Eingriffe in die Fruchtbarkeitserhaltung, Selektionsprogramme in Nutztieren und die Erhaltung gefährdeter Arten ermöglicht. Das enorme Potenzial der Eierstockreserve ist jedoch noch weitgehend ungenutzt. Bei Kühen wurden beispielsweise einige Versuche unternommen, die In-vitro-Kultur der Eizellen in bestimmten Entwicklungsstadien zu unterstützen, aber es wurden noch keine effizienten und zuverlässigen Protokolle entwickelt. Hier beschreiben wir ein Kultursystem, das die physiologischen Bedingungen des entsprechenden Follikelstadiums reproduziert, definiert, um in vitro wachsende Eizellen zu entwickeln, die aus rinderfrühen Antralenfollikel gesammelt werden, bis zum ausgewachsenen Stadium, das dem medium antralen Follikel in vivo entspricht. Eine Kombination von Hormonen und einem Phosphodiesterase-3-Hemmer wurde verwendet, um eine vorzeitige meiotische Wiederaufnahme zu verhindern und die Differenzierung der Oozyten zu steuern.

Am Ende des L-IVCO änderte sich die Bruttomorphologie der COCs und 4 Klassen wurden anhand des Aussehens der Cumuluszellen identifiziert, wie in Abbildung 2dargestellt. Basierend auf den morphologischen Kriterien, die üblicherweise zur Auswahl gesunder COCs11,26,27, der Klasse 1, 2 und 3 gewählt wurden, wurden die Klasse 4, die deutliche Anzeichen einer Degeneration wie das Fehlen vollständiger ...

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In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Wir beschreiben die Verfahren zur Isolierung wachsender Eizellen von Eierstockfollikel in frühen Entwicklungsstadien sowie den Aufbau eines In-vitro-Kultursystems, das das Wachstum und die Differenzierung bis in die ausgewachsene Phase unterstützen kann.

In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

In diesem Videoprotokoll zeigen wir im Detail, ein Kultursystem für den Anbau von Rindereioozyten. Das System unterstützt die Eizellen-Lebensfähigkeit in der Kultur für bis zu fünf Tage und ermöglicht deren Differenzierung. Mit diesem Kultursystem können Eizellen, die aus kleinen Antralinefollikel gesammelt werden, die normalerweise nicht in Standardprotokollen für In-vitro-Protokolle in der Produktion verwendet werden, angebaut werden, um die Verfügbarkeit von befruchtbaren Gameten zu erhöhen.Diese Nutzung des größeren Reservats kann neue Möglichkeiten für die genetische Bergung bedrohter Arten, der Rinderfamilie oder lokaler Rassen bieten, die von genetischer Erosion bedroht sind. Zu Beginn 15 Milliliter Grundkulturmedium vorbereiten und nach Manuskriptanweisungen ergänzen. Als nächstes bereiten Sie drei Milliliter Haltemedium vor, indem Sie dem Grundkulturmedium fünf Mikromolar-Cilostamid hinzufügen und in eine 35-Millimeter-Petrischale gießen.Bereiten Sie lange IVCO Medium durch Ergänzung der Grundkultur Medium nach Manuskript Richtungen. Fügen Sie 200 Mikroliter langes IVCO-Medium zu jedem Brunnen einer 96-well beschichteten Platte hinzu. Dann füllen Sie die vier Kanten mit sterilem Wasser, um die Verdunstung zu kompensieren und die entsprechende Feuchtigkeit während der Kultur zu erhalten.Inkubieren Sie die 96-Well-Platte und das Haltemedium bei 38,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bei maximaler Luftfeuchtigkeit. Waschen Sie die Eierstöcke viermal in steriler Salin, bei 26 Grad Celsius gehalten. Dann aspirieren Sie alle Follikel, die mehr als zwei Millimeter im Durchmesser sind, mit einer 18-Spur-Nadel, die mit einer Aspirationspumpe verbunden ist.Schnüren Sie die angesaugten Eierstöcke in einem Becher mit steriler Salin, die bei 26 Grad Celsius gehalten wird. Legen Sie einen Eierstock nach dem anderen auf ein steriles PTFE-Schneidebrett und verwenden Sie eine chirurgische Klinge der Nummer 22, um Scheiben des Eierstockhirns zu schneiden, die 1,5 bis zwei Millimeter dick sind und parallel zur Hauptachse des Organs verlaufen. Schnüren Sie die Scheiben der Eierstock-Kortex in einer sterilen Glas Petrischale, mit Sezieren Medium auf einer warmen Platte, bei 38,5 Grad Celsius.Schnüren Sie eine Ovarial-Kortexscheibe in einer 60-Millimeter-Glas-Petrischale, mit zwei bis drei Milliliterm M199D unter einem Seziermikroskop, wählen Sie die Follikel aus, die zwischen 5 und zwei Millimetern liegen. Identifizieren Sie die gesunden nicht-atretischen Follikel unter dem Stereomikroskop, indem Sie morphologische Parameter wie ein gleichmäßig helles transluzentes Erscheinungsbild, eine umfangreiche Vaskularisation und eine regelmäßige Granulosaschicht beobachten. Während atretische Follikel haben ein graues undurchsichtiges Aussehen, und sind schlecht vaskularisiert, mit einem dunklen COC im Inneren.Entsorgen Sie die atretischen Follikel und verarbeiten Sie alle anderen. Verwenden Sie die chirurgische Klinge, um das Eierstockgewebe, das den Follikel umgibt, auf einer Seite zu entfernen, bis es freigelegt wird. Verwenden Sie dann eine 26-Spur-Nadel, um sorgfältig einen Schlitz in der exponierten Follikelwand zu machen, der den Follikelgehalt freisetzt, der den COC, die Follikelflüssigkeit und die Zellklumpen umfasst.Identifizieren Sie das COC und untersuchen Sie es auf Cumulusintegrität, Zona pellucida Integrität und Homogenität des Zytoplasmas. Wenn diese Kriterien erfüllt sind, aspirieren Sie das COC mit einer P20 Pipette. Schnüren Sie das isolierte COC in M199D Cilostamid, und setzen Sie den Isolationsvorgang für 30 Minuten fort.Nach der Auswahl der COCs, wie zuvor beschrieben, bereiten Sie 16 Tropfen mit 20 Mikroliter M199D Cilostamid in einer 60-Millimeter-Petrischale vor und legen Sie einen gesunden COC in jeden Tropfen. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, das an einer Kamera befestigt ist, um den Oozytendurchmesser zu messen, mit Ausnahme der Zona pellucida. Mit einer klaren Visualisierung der Eizelle, machen Sie zwei senkrechte Messungen, stellen Sie sicher, dass der Mittelwert der beiden Messungen in einem Bereich von 100 bis 110 Mikrometern liegt.Aufgrund der begleitenden Cumuluszellen kann es schwierig sein, den Oozytendurchmesser genau zu messen. COCs, die Eizellen mit kleinerem oder größerem Durchmesser haben oder keine abgerundete Oozyte haben, oder solche mit Nicht messbaren Eizellen sollten verworfen werden. Übertragen Sie die ausgewählten COCs in eine 35-Millimeter-Schale mit M199H-Medium und halten Sie sie im Inkubator bei 38,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bei maximaler Luftfeuchtigkeit, stellen Sie sicher, dass die Gesamtarbeitszeit zwei Stunden nicht überschreitet.Sobald die Auswahl- und Abholverfahren abgeschlossen sind, übertragen Sie einen COC in die Mitte jedes Brunnens der zuvor vorbereiteten 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte für fünf Tage bei 38,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit maximaler Luftfeuchtigkeit, erfrischen Sie das Medium jeden zweiten Tag. Um das Medium zu erneuern, ersetzen Sie 100 Mikroliter des alten Mediums durch 100 Mikroliter frisches langes IVCO-Medium, tun Sie dies unter dem Stereomikroskop, um eine Verschiebung der COCs zu vermeiden.Analysieren Sie am Ende des langen IVCO die COCs-Morphologie. Wenn sie eine kompakte Cumuluszelleninvestition ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion oder Zelldegeneration haben, klassifizieren Sie sie als Klasse eins. Wenn die COCs eine kompakte Cumuluszelleninvestition ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion oder Zelldegeneration haben und mit einer oder mehreren antrumartigen Formationen, klassifizieren Sie sie als Klasse zwei.Klasse drei COCs, zeigen mehrere Schichten von Cumuluszellen ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion, einige disaggregierte Zellen in der äußeren Schicht der Cumuluszellen und keine antrumartige Bildung. Klassifizieren Sie die COCs als Klasse vier, wenn sie einen reichlichen Verlust von Cumuluszellen aufweisen, die sich über mehr als 50 % der Eizellenoberfläche erstrecken, sowie Anzeichen einer Zelldegeneration und Zellablagerungen. Am Ende der langen IVCO wird die grobe Morphologie des COC verändert.Und vier Klassen wurden anhand des Aussehens der Cumuluszellen identifiziert. Insgesamt wurden 74 Eizellen in fünf biologischen Repliken analysiert, von denen 9,45% aus der weiteren Auswertung verworfen wurden. Die Klassen eins, zwei und drei wurden als gesund eingestuft, während Klasse vier deutliche Anzeichen einer Degeneration aufwies, wie das Fehlen vollständiger Schichten von Cumuluszellen, die die Eizellen umgaben.Diese COCs wurden als ungeeignet erachtet, um sich nachgelagerten Verfahren in einer prospektiven IVP-Einstellung zu unterziehen. Die Beurteilung des meiotischen Stadiums am Ende des langen IVCO ergab, dass ein deutlich höherer Prozentsatz der Eizellen im unreifen Stadium festhielt, wobei das Chromatin noch im GV eingeschlossen war. Bei der Untersuchung der Chromatinkondensation innerhalb des GV als Marker des Kompetenzgewinns wurde in 59 % der Eizellen der Übergang der Chromatinkonfiguration zu kondensierteren Stufen, nämlich GV zwei und GV 3, beobachtet. Ein kleiner Prozentsatz nahm die Meiose wieder auf und erreichte eine Phase der Metaphase oder Degeneration.Diese Ergebnisse zeigen, dass die L-IVCO-Kultur die Eizellenlebensfähigkeit unterstützt und gleichzeitig die meiotische Wiederaufnahme für fünf Tage verhindert. Am Ende der langen IVCO können die COCs in nachgelagerten Verfahren der In-vitro-Embryoproduktion eingesetzt werden, nämlich in vitro reifung, Fertilisation und Embryokultur. Diese Schritte sind notwendig, um den Beweis des Konzepts zu erbringen, dass die Eizelle eine höhere Entwicklungskompetenz erworben hat.Neben dem Potenzial, die Menge an befruchtbaren Eizellen zu erhöhen, ist das lange IVCO-Kultursystem ein Werkzeug für Wissenschaftler, die daran interessiert sind, die zellulären und molekularen Prozesse zu sezieren, die die Bildung einer kompetenten Gamete regulieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...