Name: in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle
Uploaded: 2020-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 e UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Le ovaie sono state raccolte da 4 a 8 anni di vacche da latte Holstein recuperate presso il mattatoio locale (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italia).
1. Preparazione dei supporti
NOTA: tutti i supporti devono essere preparati almeno quattro ore prima dell'uso. I supporti tamponi di bicarbonato di sodio vengono incubati a 38,5 gradi centigradi e al 5% di CO2 nell'aria, massima umidità. I supporti tamponati HEPES sono mantenuti a 38,5...

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	<li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Oocytes+in+Vitro.">Maturation of Oocytes in Vitro.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).</li><li>Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+communications+regulate+chromatin+remodeling+during+bovine+oocyte+growth+and+differentiation+through+cAMP-dependent+mechanism(s).">Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s).</a> Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).</li><li>McLaughlin, M., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+bovine+primordial+follicles+is+promoted+by+activin+and+FSH+within+a+two-step+serum-free+culture+system.">Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system.</a> Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).</li><li>Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achievements+and+unmet+promises+of+assisted+reproduction+technologies+in+large+animals:+a+per-sonal+perspective.">Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective.</a> Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).</li><li>Luciano, A. M., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+in+vitro+maturation+of+oocytes:+a+matter+of+follicular+differentiation.">Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation.</a> Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).</li><li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-produced+bovine+embryos:+dealing+with+the+warts.">In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts.</a> Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).</li><li>Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+reserve+of+primordial+follicles+and+the+dynamic+reserve+of+antral+growing+follicles:+what+is+the+link.">The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link.</a> Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).</li><li>Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+of+follicles+in+the+ovary+of+the+cow.">Growth rates of follicles in the ovary of the cow.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).</li><li>Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+ultrastructure+in+bovine+primordial+to+early+tertiary+follicles.">Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles.</a> Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).</li><li>Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+developmental+competence+of+bovine+oocytes+derived+from+different+categories+of+antral+follicles.">Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles.</a> Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).</li><li>Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+and+follicular+morphology+as+determining+characteristics+for+developmental+competence+in+bovine+oocytes.">Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).</li><li>Harada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+from+early+antral+follicles+grow+to+meiotic+competence+in+vitro:+effect+of+FSH+and+hypoxanthine.">Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine.</a> Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).</li><li>Hirao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+and+development+of+bovine+oocyte-granulosa+cell+complexes+on+the+flat+substratum:+effects+of+high+polyvinylpyrrolidone+concentration+in+culture+medium.">In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).</li><li>Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+meiotic+competence+of+bovine+oocytes+originating+from+early+antral+ovarian+follicles.">Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles.</a> Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).</li><li>Taketsuru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+in+secondary+follicles+grow+in+medium+containing+bovine+plasma+after+vitrification.">Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+supports+in+vitro+development+of+bovine+early+antral+follicles.">Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles.</a> Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+promote+bovine+oocyte+growth+and+connection+with+granulosa+cells.">Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells.</a> Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+to+live+young+from+bovine+small+oocytes+after+growth,+maturation+and+fertilization+in+vitro.">Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro.</a> Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).</li><li>Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PDE3A+sustains+meiotic+arrest+and+gap+junction+of+bovine+growing+oocytes+in+in+vitro+growth+culture.">Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture.</a> Theriogenology. 118, 110-118 (2018).</li><li>Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. 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C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+interact+with+natriuretic+peptide+C+to+delay+nuclear+maturation,+to+maintain+oocyte-cumulus+communication+and+to+improve+the+quality+of+in+vitro-produced+embryos+in+cattle.">Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle.</a> Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+control+of+oocyte+large-scale+chromatin+configuration+in+different+cattle+breeds.">Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds.</a> Theriogenology. 141, 146-152 (2020).</li><li>Franciosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+precursor+C+delays+meiotic+resumption+and+sustains+gap+junction-mediated+communication+in+bovine+cumulus-enclosed+oocytes.">Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes.</a> Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+levels+of+intracellular+cAMP+on+the+in+vitro+maturation+of+cattle+oocytes+and+their+subsequent+development+following+in+vitro+fertilization.">Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization.</a> Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).</li><li>Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oocyte+quality+on+development+and+transcriptional+activity+in+early+bovine+embryos.">Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos.</a> Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cilostamide+on+gap+junction+communication+dynamics,+chromatin+remodeling,+and+competence+acquisition+in+pig+oocytes+following+parthenogenetic+activation+and+nuclear+transfer.">The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer.</a> Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).</li><li>Shu, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+supports+transcription+and+improves+meiotic+competence+of+growing+bovine+oocytes.">Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes.</a> Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).</li><li>Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrophin+and+steroid+concentrations+in+bovine+follicular+fluid+and+their+relationship+to+follicle+size.">Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).</li><li>Kruip, T. A., Dieleman, S. 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A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+actions+and+the+ovary.">Androgen actions and the ovary.</a> Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).</li><li>Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+inhibits+large+granulosa+cell+apoptosis+by+stimulating+progesterone+synthesis+and+regulating+the+distribution+of+intracellular+free+calcium.">Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium.</a> Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).</li><li>Gordon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).</li><li>Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+serum-free+culture+system+supports+development+of+human+oocytes+from+primordial+follicles+in+the+presence+of+activin.">A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin.</a> Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocyte+diameter+in+relation+to+maturational+competence+and+transcriptional+activity.">Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).</li></ol>

Qui descriviamo un sistema culturale per la crescita degli ovociti che promuove lo sviluppo degli ovociti per 5 giorni sostenendone la vitalità e prevenendo la ripresa meiotica. Quest'ultimo aspetto è di estrema importanza per consentire la continua crescita e differenziazione necessaria per conferire all'ovocita la competenza dello sviluppo meiotico ed embrionale2,20, che sarebbe altrimenti bloccata da una ripresa prematura della divisione meiotica.
<p cla...

Durante la durata della vita riproduttiva, solo una frazione minima degli oociti che sono presenti in un maturo ovarico, vengono rilasciati nelle tube di Falloppio dopo l'ovulazione e sono disponibili per essere fecondati e svilupparsi in un embrionevitale 1. D'altra parte, la maggior parte degli oociti all'interno di un'ovaia subiscono atresia e non sono mai ovulati. Le tecnologie di produzione di embrioni in vitro (IVP) hanno tentato di aumentare lo sfruttamento della riservaovarica 2,3. Finora, tali tecnologie hanno permesso interventi di conservazione della fertilità, programmi di selezione nel bestiame e conservazione delle specie in via di estinzione. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli utilizza oociti che hanno fondamentalmente completato la fase di crescita all'interno del follicolo ovarico astrale, e quindi sono indicati come oociti completamente cresciuti. Nei bovini, dove le tecnologie IVP sono ampiamente utilizzate, gli ovociti completamente cresciuti raggiungono un diametro finale di circa 120 m e vengono raccolti da follicoli che si estendono da 2 a 8 mm di diametro (follicoli antrali medi)1. Dopo l'isolamento dai follicoli, tali oociti sono in vitro maturati e fecondati. Gli zigoti vengono poi rilaccati fino alla fase di blastocisti e trasferiti in un destinatario o crioconservati. Nel bestiame, così come in molte altre specie, nonostante il potenziale offerto dall'IVP, il numero di embrioni prodotti in vitro per mucca non è migliorato in gran parte negli ultimi 40 anni. Ciò è in parte dovuto al numero limitato di ovociti completamente cresciuti che popolano un'ovaia in un dato momento che può essere recuperata e sottoposta a tecniche IVP standard4,5,6.
Gli ovociti racchiusi all'interno dei primi follicoli antrali, cioè quei follicoli di diametro inferiore a 2 mm, rappresentano una potenziale fonte da utilizzare nei programmi di conservazione dellafertilità 7 , poiché un'ovaia contiene approssimativamente 10 volte più follicoli antrali precoci rispetto al medio antral8. Tuttavia, questi oociti sono ancora in fase di crescita e non hanno ancora raggiunto la fase9completamente cresciuta . Come tale, sono ancora trascrizionalmente attivi, producendo mRNA che saranno conservati per fasi successive di sviluppo, e non hanno ancora subito tutto il processo di differenziazione necessario per conferire agli ovociti la capacità di riprendere e completare spontaneamente la meiosi che una volta isolato dal compartimento follicolare10,11. Pertanto, non possono essere sottoposti direttamente ai protocolli standard di maturazione in vitro (IVM), ma richiedono un ulteriore periodo di coltura che permetta loro di completare la fase di crescita e differenziare correttamente.
La transizione dallo stadio di crescita a quello completamente cresciuto, che nel bestiame si verifica quando il follicolo si sviluppa dallo stadio astrale iniziale allo stadio astrale medio, è uno dei passaggi critici durante lo sviluppo degli ovociti. Nel bestiame, diversi studi hanno tentato di ricapitolare questi eventi in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Tuttavia, ad oggi non sono stati sviluppati protocolli affidabili e sono stati segnalati solo un successo limitato. Secondo gli studi precedenti20, questi ovociti in crescita costituiscono una popolazione omogenea. Oltre ad essere trascrizionalmente attivo, la loro cromatina è dispersa nel vescicolo germino (GV), in una configurazione denominata GV02,21. Al contrario, la popolazione di oociti completamente cresciuti ottenuti da follicoli antrali medi è più eterogenea, una condizione che si riflette con i vari gradi di compattazione della cromatina (GV1, GV2 e GV3) che possono essere osservati20. Tra questi, i dati precedenti hanno dimostrato che gli oociti GV2 e GV3 sono complessivamente caratterizzati da una migliore qualità e una maggiore competenza dello sviluppoembrionale 20,21,22,23,24.
A partire dalle osservazioni di cui sopra, qui descriviamo un sistema di coltura di 5 giorni di ovociti (L-IVCO) che permette la differenziazione degli ovociti isolati come complessi cumuli-oociti (COC) dai primi follicoli astrali. Questa strategia culturale si è evoluta da 10 anni di studi condotti nel nostro laboratorio e affonda le sue radici sulla 24-48 ore di coltura ociocita in vitro precedentemente sviluppata (IVCO)2, sistemi diprematurazione 23,25 e il completamento dello zinco durante la coltura degli oocidi . Una combinazione di ormone stimolante follicolo (FSH) e un inibitore fosfodiesterase-3 (PDE3), in grado di migliorare la comunicazione cumulus-oocita2, prevenire la ripresa meiotica intempese2, e supporto crescita ovocita2 è stato utilizzato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:215px;">4-well dishes</td>
			<td style="width:127px;">Nunclon</td>
			<td style="width:123px;">179830</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:215px;">96-well dish</td>
			<td style="width:127px;">Becton Dickinson Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">356649</td>
			<td>BioCoat&#8482; Collagen I</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell culture water</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cilostamide</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>C7971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cysteamine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td>Camera DS-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glutamax Supplement</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gonal F</td>
			<td style="width:127px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Heparin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hepes</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Vacuum pump</td>
			<td>Cook-IVF</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Sanyo</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M3769</td>
			<td style="width:171px;">Powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2520</td>
			<td>Powder for M199-D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Corp</td>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td style="width:123px;">Eclipse E 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicilin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>360k molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Progesterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium choride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Testosterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">H1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle

La riserva limitata di oociti maturi e fertilizzanti rappresenta una grande barriera per il successo della riproduzione assistita nei mammiferi. Considerando che durante la durata della vita riproduttiva solo circa l'1% degli ovociti in un ovaio maturo e ovulato, sono state sviluppate diverse tecniche per aumentare lo sfruttamento della riserva ovarica alla crescente popolazione di follicoli non ovulatori. Tali tecnologie hanno permesso interventi di conservazione della fertilità, programmi di selezione nel bestiame e conservazione delle specie in via di estinzione. Tuttavia, il vasto potenziale della riserva ovarica è ancora in gran parte non sfruttato. Nelle mucche, ad esempio, sono stati fatti alcuni tentativi di sostenere la coltura in vitro degli ociociti in fasi di sviluppo specifiche, ma non sono ancora stati sviluppati protocolli efficienti e affidabili. Qui descriviamo un sistema di coltura che riproduce le condizioni fisiologiche del corrispondente stadio follicolare, definito per sviluppare ovociti di crescita in vitro raccolti dai follicoli antrali primi bovini allo stadio completamente cresciuto, corrispondente al follicolo antralco medio in vivo. Una combinazione di ormoni e un inibitore fosfodiesterase 3 è stato utilizzato per prevenire la ripresa meiotica intempestivo e per guidare la differenziazione degli ovociti.

Alla fine del L-IVCO, la morfologia lorda dei COC è cambiata e 4 classi sono state identificate in base all'aspetto delle cellule cumuli, come mostrato nella Figura 2. Sulla base dei criteri morfologici comunemente adottati per selezionare i COCsani 11,26,27, le classi 1, 2 e 3 sono state giudicate sane, mentre la classe 4, che mostrava chiari segni di degenerazione come l'assenza di strati complet...

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In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Descriviamo le procedure per l'isolamento degli ovociti di crescita dai follicoli ovaiosi nelle prime fasi di sviluppo, nonché l'installazione di un sistema di coltura in vitro in grado di sostenere la crescita e la differenziazione fino allo stadio completamente cresciuto.

Strategia di coltura in vitro per oociti dal follicolo antralico precoce nel bestiame

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

In questo protocollo video, dimostriamo in dettaglio un sistema di coltura per la coltivazione di ovociti bovini. Il sistema supporta la vitalità degli ovociti nella cultura per un massimo di cinque giorni e consente la loro differenziazione. Utilizzando questo sistema di coltura, gli ovociti raccolti da piccoli follicoli astrali, che normalmente non sono utilizzati nei protocolli standard per l'in vitro nella produzione, possono essere coltivati per aumentare la disponibilità di gameti fertilizzabili.Questo sfruttamento della riserva più ampia può fornire nuove opzioni per il recupero genetico di specie minacciate, della famiglia bovina o di razze locali a rischio di erosione genetica. Per iniziare, preparare 15 millilitri di terreno di coltura di base e completarlo secondo le indicazioni manoscritte. Successivamente, preparare tre millilitri di mezzo di tenuta aggiungendo cinque cilostamide micromolare al mezzo di coltura di base e versarlo in una piastra di Petri da 35 millimetri.Preparare un lungo mezzo IVCO integrando il mezzo di coltura di base secondo le indicazioni manoscritte. Aggiungere 200 microlitri di mezzo IVCO lungo ad ogni pozzo di una piastra rivestita a 96 porri. Quindi riempire i quattro bordi con acqua sterile per compensare l'evaporazione e mantenere l'umidità appropriata durante la coltura.Incubare la piastra da 96 pozzi e il mezzo di tenuta a 38,5 gradi celsius e il 5% di anidride carbonica con umidità massima. Lavare le ovaie quattro volte in soluzione salina sterile, mantenuta a 26 gradi Celsius. Quindi aspirare tutti i follicoli di diametro superiore a due millimetri, con un ago calibro 18 collegato a una pompa di aspirazione.Allaga le ovaie aspirate in un becher con soluzione salina sterile mantenuta a 26 gradi Celsius. Posizionare un'ovaia alla volta su un tagliere PTFE sterile e utilizzare una lama chirurgica numero 22 per tagliare fette di corteccia ovarica dello spessore da 1,5 a due millimetri e parallele all'asse principale dell'organo. Allattare le fette di corteccia ovarica in una piastra di Petri di vetro sterile, con mezzo sezionante su un piatto caldo, a 38,5 gradi celsius.Pizzo una fetta di corteccia ovarica in una piastra di Petri di vetro da 60 millimetri, con due o tre millilitri di M199D al microscopio a dissezione, selezionare i follicoli che sono tra i 5 e i due millimetri. Identificare i follicoli non atretici sani al microscopio stereo, osservando parametri morfologici, come un aspetto traslucido uniformemente luminoso, un'ampia vascolarizzazione e un normale strato di granulosa. Mentre i follicoli atretici hanno un aspetto opaco grigio e sono scarsamente vascolarizzati, con un COC scuro all'interno.Scartare i follicoli atretici ed elaborare tutti gli altri. Utilizzare la lama chirurgica per rimuovere il tessuto ovarico che circonda il follicolo su un lato, fino a quando non viene esposto. Quindi utilizzare un ago calibro 26 per fare con cura una fessura nella parete del follicolo esposta, che rilascerà il contenuto follicolare che comprende coc, liquido follicolare e ciuffi di cellule.Identificare il COC ed esaminarlo per l'integrità cumulica, l'integrità della zona pellucida e l'omogeneità del citoplasma. Se questi criteri sono soddisfatti, aspirare il COC con una pipetta P20. Allagare il COC isolato nella cilostamide M199D e continuare la procedura di isolamento per 30 minuti.Dopo aver selezionato i COC, come descritto in precedenza, preparare 16 gocce con 20 microlitri di cilostamide M199D in una piastra di Petri da 60 millimetri e mettere un COC sano in ogni goccia. Utilizzare un microscopio invertito collegato a una telecamera per misurare il diametro degli ovociti, esclusa la zona pellucida. Con una chiara visualizzazione dell'ovocita, effettuare due misurazioni perpendicolari, assicurare che la media delle due misurazioni sia entro un intervallo da 100 a 110 micrometri.Può essere difficile misurare con precisione il diametro degli ovociti, a causa delle cellule cumuliche compagno. I COC con ovociti con diametro inferiore o maggiore, o che non hanno un ovociti arrotondato, o quelli con ovociti non misurabili, devono essere scartati. Trasferire i COC selezionati in un piatto da 35 millimetri contenente mezzo M199H e mantenerli nell'incubatrice a 38,5 gradi celsius e 5% di anidride carbonica con umidità massima, assicurarsi che l'orario di lavoro complessivo non superi le due ore.Una volta completate le procedure di selezione e raccolta, trasferire un COC al centro di ogni pozzo della piastra da 96 pozzi precedentemente preparata. Incubare la piastra per cinque giorni a 38,5 gradi celsius e 5% di anidride carbonica con umidità massima, rinfrescare il mezzo a giorni diversi. Per rinnovare il mezzo, sostituire 100 microlitri di vecchio mezzo con 100 microlitri di mezzo IVCO fresco lungo, farlo al microscopio stereo per evitare di spostare i COC.Al termine del lungo IVCO, analizzare la morfologia dei COC. Se hanno un investimento compatto in cellule cumuliche senza alcun segno di espansione cumulo, o degenerazione cellulare, classificarli come classe uno. Se i COC hanno un investimento compatto di cellule cumuliche senza alcun segno di espansione cumulo o degenerazione cellulare, e con una o più formazioni simili ad antrum, classificarli come classe due.I COC di classe tre mostrano diversi strati di cellule cumuliche senza alcun segno di espansione cumulo, alcune cellule disaggregate nello strato esterno delle cellule cumuliche e nessuna formazione simile all'antrum. Classificare i COC come classe quattro se mostrano un'abbondante perdita di cellule cumuliche che si estendono per oltre il 50% della superficie degli ovociti, così come segni di degenerazione cellulare e detriti cellulari. Alla fine del lungo IVCO la morfologia lorda del COC viene modificata.E quattro classi sono state identificate in base all'aspetto delle cellule cumuli. Complessivamente, sono stati analizzati 74 ovociti in cinque repliche biologiche, di cui il 9,45% è stato scartato da ulteriori valutazioni. Le classi uno, due e tre furono giudicate sane, mentre la quarta classe mostrò chiari segni di degenerazione, come l'assenza di strati completi di cellule cumuliche che circondavano gli ovociti.Questi COC sono stati considerati inadatti a sottoporsi a procedure a valle in un potenziale ambiente IVP. La valutazione della fase meiotica alla fine del lungo IVCO ha mostrato che una percentuale significativamente più elevata di ovociti è rimasta arrestata nella fase immatura, con la cromatina ancora racchiusa all'interno del GV. Quando la condensazione della cromatina all'interno del GV è stata studiata come indicatore di guadagno di competenza, la transizione della configurazione della cromatina a stadi più condensati, vale a dire GV due e GV tre, è stata osservata nel 59% degli ovociti. Una piccola percentuale ha ripreso la meiosi raggiungendo la metafase in uno stadio, o degenerazione.Questi risultati dimostrano che la cultura L-IVCO supporta la vitalità degli ovocite, impedendo al contempo la ripresa meiotica per cinque giorni. Alla fine del lungo IVCO, i COC possono essere utilizzati nelle procedure a valle della produzione di embrioni in vitro, vale a dire la maturazione in vitro, la fecondazione e la coltura embrionale. Queste misure sono necessarie per fornire la prova del concetto che l'ovocita ha acquisito una maggiore competenza allo sviluppo.Oltre a mantenere il potenziale di aumentare la quantità di ovociti fertilizzabili, il lungo sistema di coltura IVCO è uno strumento per gli scienziati interessati a sezionare i processi cellulari e molecolari che regolano la formazione di un gamete competente.

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Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

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