Name: in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle
Uploaded: 2020-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

이 작품은 지역 롬바르디아 PSR INNOVA n.201801061529 및 UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01 의해 지원되었다

난소는 4세에서 8세까지 의 현지 아바토이르(INALCA S.p.A., 오스페달레토 로디가노, LO, IT 2270M CE, 이탈리아)에서 회수되었습니다.
1. 미디어 준비
참고: 모든 미디어는 사용하기 최소 4시간 전에 준비해야 합니다. 중탄산나트륨 완충매체는 공기 중 38.5°C, 최대 습도 5%CO2로 배양됩니다. HEPES 버퍼링 된 매체는 온도성 오븐에서 38.5 °C에서 유지됩니다.
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	<li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Oocytes+in+Vitro.">Maturation of Oocytes in Vitro.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).</li><li>Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+communications+regulate+chromatin+remodeling+during+bovine+oocyte+growth+and+differentiation+through+cAMP-dependent+mechanism(s).">Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s).</a> Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).</li><li>McLaughlin, M., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+bovine+primordial+follicles+is+promoted+by+activin+and+FSH+within+a+two-step+serum-free+culture+system.">Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system.</a> Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).</li><li>Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achievements+and+unmet+promises+of+assisted+reproduction+technologies+in+large+animals:+a+per-sonal+perspective.">Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective.</a> Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).</li><li>Luciano, A. M., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+in+vitro+maturation+of+oocytes:+a+matter+of+follicular+differentiation.">Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation.</a> Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).</li><li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-produced+bovine+embryos:+dealing+with+the+warts.">In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts.</a> Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).</li><li>Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+reserve+of+primordial+follicles+and+the+dynamic+reserve+of+antral+growing+follicles:+what+is+the+link.">The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link.</a> Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).</li><li>Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+of+follicles+in+the+ovary+of+the+cow.">Growth rates of follicles in the ovary of the cow.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).</li><li>Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+ultrastructure+in+bovine+primordial+to+early+tertiary+follicles.">Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles.</a> Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).</li><li>Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+developmental+competence+of+bovine+oocytes+derived+from+different+categories+of+antral+follicles.">Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles.</a> Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).</li><li>Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+and+follicular+morphology+as+determining+characteristics+for+developmental+competence+in+bovine+oocytes.">Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).</li><li>Harada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+from+early+antral+follicles+grow+to+meiotic+competence+in+vitro:+effect+of+FSH+and+hypoxanthine.">Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine.</a> Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).</li><li>Hirao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+and+development+of+bovine+oocyte-granulosa+cell+complexes+on+the+flat+substratum:+effects+of+high+polyvinylpyrrolidone+concentration+in+culture+medium.">In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).</li><li>Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+meiotic+competence+of+bovine+oocytes+originating+from+early+antral+ovarian+follicles.">Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles.</a> Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).</li><li>Taketsuru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+in+secondary+follicles+grow+in+medium+containing+bovine+plasma+after+vitrification.">Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+supports+in+vitro+development+of+bovine+early+antral+follicles.">Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles.</a> Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+promote+bovine+oocyte+growth+and+connection+with+granulosa+cells.">Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells.</a> Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+to+live+young+from+bovine+small+oocytes+after+growth,+maturation+and+fertilization+in+vitro.">Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro.</a> Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).</li><li>Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PDE3A+sustains+meiotic+arrest+and+gap+junction+of+bovine+growing+oocytes+in+in+vitro+growth+culture.">Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture.</a> Theriogenology. 118, 110-118 (2018).</li><li>Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+chromatin+remodeling+in+germinal+vesicle+bovine+oocytes:+interplay+with+gap+junction+functionality+and+developmental+competence.">Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+morphology+and+transcriptional+silencing+in+relation+to+chromatin+remodeling+during+the+final+phases+of+bovine+oocyte+growth.">Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+cumulus+cell+gene+expression+indicate+the+benefit+of+a+pre-maturation+step+to+improve+in-vitro+bovine+embryo+production.">Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production.</a> Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+interact+with+natriuretic+peptide+C+to+delay+nuclear+maturation,+to+maintain+oocyte-cumulus+communication+and+to+improve+the+quality+of+in+vitro-produced+embryos+in+cattle.">Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle.</a> Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+control+of+oocyte+large-scale+chromatin+configuration+in+different+cattle+breeds.">Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds.</a> Theriogenology. 141, 146-152 (2020).</li><li>Franciosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+precursor+C+delays+meiotic+resumption+and+sustains+gap+junction-mediated+communication+in+bovine+cumulus-enclosed+oocytes.">Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes.</a> Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+levels+of+intracellular+cAMP+on+the+in+vitro+maturation+of+cattle+oocytes+and+their+subsequent+development+following+in+vitro+fertilization.">Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization.</a> Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).</li><li>Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oocyte+quality+on+development+and+transcriptional+activity+in+early+bovine+embryos.">Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos.</a> Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cilostamide+on+gap+junction+communication+dynamics,+chromatin+remodeling,+and+competence+acquisition+in+pig+oocytes+following+parthenogenetic+activation+and+nuclear+transfer.">The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer.</a> Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).</li><li>Shu, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+supports+transcription+and+improves+meiotic+competence+of+growing+bovine+oocytes.">Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes.</a> Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).</li><li>Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+concentrations+in+the+fluid+of+bovine+follicles+relative+to+size,+quality+and+stage+of+the+oestrus+cycle.">Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle.</a> Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).</li><li>Sakaguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+antral+follicle+count,+steroidogenesis,+and+secretion+of+follicle-stimulating+hormone+and+anti-Mullerian+hormone+during+follicular+growth+in+cattle.">Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+promote+the+acquisition+of+maturation+competence+in+bovine+oocytes.">Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes.</a> Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).</li><li>Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+actions+and+the+ovary.">Androgen actions and the ovary.</a> Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).</li><li>Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+serum-free+culture+system+supports+development+of+human+oocytes+from+primordial+follicles+in+the+presence+of+activin.">A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin.</a> Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocyte+diameter+in+relation+to+maturational+competence+and+transcriptional+activity.">Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).</li></ol>

여기서 우리는 그들의 생존력을 지원하고 메이오틱 재개를 방지하여 5 일 동안 난낭 개발을 촉진하는 난모세포 재배를위한 문화 시스템을 설명합니다. 이러한 후자의 측면은 메이오능 및 배아 발달 능력2,,20과난낭을 부여하는 데 필요한 지속적인 성장과 분화를 허용하는 것이 가장 중요합니다.
이 배양 시스템을 개발할 때, 우리는 ...

생식 수명 동안 난소에 존재하는 난소의 극히 일부만 성숙하고 배란 시 나팔관에서 방출되며, 수정되어 실행 가능한 배아1로발전할 수 있다. 다른 한편으로는, 난소 내의 난모세포의 대부분은 atresia를 겪고 결코 배란되지 않습니다. 시험관 내 배아 생산(IVP) 기술은 난소예비2,,3의착취를 증가시키려 고 시도했다. 지금까지 이러한 기술은 불임 보존, 가축 의 선택 프로그램 및 멸종 위기 종의 보존에 대한 개입을 허용했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 대부분의 프로토콜 은 기본적으로 개소 난소 여포 내에서 성장 단계를 완료 한 난모 세포를 사용 하 여, 따라서 완전히 성장 된 난모 세포로 언급. IVP 기술이 널리 사용되는 가축에서는 완전히 자란 난모세포가 약 120 μm의 최종 직경에 도달하고 직경 2~8mm(중간 개미 여포)1에이르는 여포로부터 채취된다. 여포에서 격리되면, 이러한 난모세포는 체외에서 성숙하고 수정됩니다. 그런 다음 zygotes는 배아세포 단계까지 배양되고 수령인 또는 냉동 보존으로 옮겨갑니다. 가축에서뿐만 아니라 다른 많은 종에서, IVP에 의해 제공 된 잠재력에도 불구하고, 소 당 생체 외 생산 배아의 수는 크게 지난 40 년 동안 개선되지 않았다. 이는 주어진 시간에 난소를 채우는 완전히 자란 난소의 수가 제한되어 있기 때문에 부분적으로 표준 IVP 기술4,,5,,6을회수하고 복종할 수 있다.
초기 개미 여포 내에서 동봉된 난초, 즉 직경이 2mm 미만인 여포는 불임 보존 프로그램7에서 사용할 수 있는 잠재적인 근원을 나타내며, 난소는 대략 중간 개미8보다10배 더 이른 개량여제를 함유하고 있다. 그러나, 이러한 난모세포는 여전히 성장 단계에 있으며 아직 완전히 성장 한단계 9에도달하지 않았습니다. 이와 같이, 그들은 여전히 전사 활성, 나중에 발달 단계에 저장됩니다 mRNA를 생산, 아직 자발적으로 재개하고 meiosis를 완료의 능력으로 난모를 부여하는 데 필요한 모든 분화 과정을 겪지 않은 나는 한 번 여포 구획에서 분리10,,11. 따라서 표준 시험관 성숙(IVM) 프로토콜에 직접 제출할 수는 없지만 성장 단계를 완료하고 적절하게 차별화할 수 있는 추가 문화 기간이 필요합니다.
여포가 초기 개랑자에서 중간 개소 단계로 발전할 때 발생하는 완전히 자란 단계로의 전환은 난모세포 발달 중 중요한 단계 중 하나입니다. 가축에서, 몇몇 연구 결과는 시험관 외2,,,,12,13,14,,15,,16,17,,18,,19에서이 사건을 재구성하는 것을 시도했습니다., 그러나 현재까지 신뢰할 수 있는 프로토콜이 개발되지 않았으며 제한된 성공만 보고되었습니다. 이전 연구에 따르면20,이러한 성장 난모세포는 균일 한 인구를 구성. 전사활성 외에도, 그들의 크로마틴은 GV02,21이라는구성으로 발아 소포(GV)에2분산된다. 반대로, 중형 개포로부터 수득된 완전히 자란 난모세포의 인구는 이질적이며,20을관찰할 수 있는 크로마틴 다짐(GV1, GV2 및 GV3)의 다양한 정도에 의해 미러되는 상태이다. 이들 중, 이전 데이터는 GV2 와 GV3 난모세포가 전반적으로 더 나은 품질과 더 높은 배아 발달 능력(20,,21,,22, 23,,,24)을특징으로하는 것으로 나타났습니다.23
위의 관찰부터 시작하여, 우리는 초기 개울 여포에서 적혈구 -oocyte 복합체 (COC)로 격리 된 난모 세포의 분화를 허용하는 5 일 간의 긴 배양 시스템을 설명합니다. 이러한 배양 전략은 실험실에서 10년 동안 진행된 연구에서 진화하여 이전에 개발된 시험관 내분비 배양(IVCO)2,선조 시스템23,25 및난소 배양 시 아연 보충제에 뿌리를 두고 있다. 여포 자극 호르몬(FSH)과 인포디스세라제-3(PDE3) 억제제의 조합으로, 적정성-난낭화통신2를향상시킬 수 있고, 불시의 메이오틱 재개2를방지하고, 난낭 성장2를 지원하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:215px;">4-well dishes</td>
			<td style="width:127px;">Nunclon</td>
			<td style="width:123px;">179830</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:215px;">96-well dish</td>
			<td style="width:127px;">Becton Dickinson Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">356649</td>
			<td>BioCoat&#8482; Collagen I</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell culture water</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cilostamide</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>C7971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cysteamine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td>Camera DS-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glutamax Supplement</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gonal F</td>
			<td style="width:127px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Heparin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hepes</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Vacuum pump</td>
			<td>Cook-IVF</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Sanyo</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M3769</td>
			<td style="width:171px;">Powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2520</td>
			<td>Powder for M199-D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Corp</td>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td style="width:123px;">Eclipse E 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicilin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>360k molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Progesterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium choride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Testosterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">H1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle

성숙하고 열렬한 난모세포의 제한된 예비는 포유류에서 보조 번식의 성공을위한 주요 장벽을 나타냅니다. 생식 수명이 성숙하고 배란되는 난소세포의 약 1%에 불과하다는 점을 고려할 때, 난소 보호구역의 착취를 비배란 여포의 인구증가로 증가시키는 몇 가지 기술이 개발되었다. 이러한 기술은 불임 보존, 가축 의 선택 프로그램 및 멸종 위기에 처한 종의 보존에 대한 개입을 허용했습니다. 그러나 난소 보호구역의 광대한 잠재력은 여전히 크게 악용되지 않습니다. 예를 들어, 소에서는 특정 발달 단계에서 난모세포의 체외 문화를 지원하기 위한 시도가 있었지만 효율적이고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 아직 개발되지 않았습니다. 여기서 우리는 생체 내의 중간 개성적인 여포에 대응하는 소 초기 개량 여포에서 완전히 자란 단계로 소 초기 개량 여포에서 수집된 체외 성장 난모를 개발하기 위해 정의된 해당 여포 단계의 생리적 조건을 재현하는 배양 시스템을 설명합니다. 호르몬과 인포디세아제 3 억제제의 조합은 불시의 메이오틱 재개를 방지하고 난소 세포의 분화를 안내하는 데 사용되었다.

L-IVCO의 끝에서, COC의 총 형태는 도 2에도시된 바와 같이 적수 세포의 외관에 기초하여 4개의 클래스가 변경되고 4개의 클래스를 확인하였다. 건강한 COC11,,26,27,클래스1,2 및 3을 선택하기 위해 일반적으로 채택된 형태학적 기준에 기초하여 건강한 것으로 판단되었으며, 난미세포를 둘러싼 적혈구의 완전한 ...

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In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

우리는 발달의 초기 단계에서 난소 여포에서 성장 난모세포의 분리절차뿐만 아니라 완전히 자란 단계까지 성장과 차별화를 지원할 수있는 체외 문화 시스템의 설정에 대해 설명합니다.

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

이 비디오 프로토콜에서는 소 난모세포 증가를 위한 문화 시스템인 세부 사항을 자세히 보여줍니다. 이 시스템은 최대 5일 동안 배양물 생존가능성을 지원하며 차별화를 가능하게 합니다. 이러한 배양 시스템을 사용하면 일반적으로 생산 시 체외에서 표준 프로토콜에 사용되지 않는 작은 개소여포에서 채취한 난모세포는 열성 게임의 가용성을 높이기 위해 재배될 수 있다.더 넓은 예비의이 착취, 위협 종의 유전 구출에 대 한 새로운 옵션을 제공할 수 있습니다., 소 가족의, 또는 유전 침식의 위험에 로컬 품종. 시작하려면 기본 문화 배지의 15 밀리리터를 준비하고 원고 의 지시에 따라 보충하십시오. 다음으로, 기본 배양 배지에 5개의 마이크로몰러 시로스타미드를 추가하여 3밀리리터를 보유하고 35mm 페트리 접시에 붓습니다.원고 의 방향에 따라 기본 문화 매체를 보충하여 긴 IVCO 매체를 준비하십시오. 96웰 코팅 플레이트의 각 웰에 긴 IVCO 배지 200 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 4개의 가장자리를 멸균물로 채우고 증발을 보정하고 문화 중에 적절한 습도를 유지합니다.96웰 플레이트와 홀딩 배지를 섭씨 38.5도, 최대 습도가 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 난소를 멸균 식염수로 4번 씻고 섭씨 26도에서 유지합니다. 그런 다음 직경이 2밀리미터 이상인 모든 여포를 흡인하고 18 게이지 바늘이 포부 펌프에 연결됩니다.멸균 식염수로 비커에 흡인 난소를 레이스26°C까지 유지합니다. 멸균 PTFE 도마에 한 번에 하나의 난소를 놓고 수술 번호 22 블레이드를 사용하여 1.5 ~ 2 밀리미터 두께의 난소 피질의 조각을 자르고 장기의 주요 축과 평행합니다. 멸균 유리 페트리 접시에 난소 피질의 조각을 레이스, 따뜻한 접시에 해부 매체와, 섭씨 38.5도에서.60mm 유리 페트리 접시에 있는 레이스 1 난소 피질 슬라이스, 해부 현미경에서 M199D의 2~3 밀리리터와 함께, 5~2 밀리미터 사이 여포를 선택합니다. 균일하게 밝은 반투명 외관, 광범위한 혈관화 및 일반 과립과층과 같은 형태학적 매개 변수를 관찰하여 스테레오 현미경하에서 건강한 비-atretic 여포를 식별합니다. 폐색 여포는 회색 불투명한 외관을 가지고 있지만, 내부 어두운 COC와 함께, 제대로 혈관이 없습니다.폐여모를 버리고 다른 모든 것을 처리합니다. 수술 용 블레이드를 사용하여 한쪽에 여포를 둘러싼 난소 조직을 제거하십시오. 그런 다음 26 게이지 바늘을 사용하여 노출된 여포 벽에 슬릿을 조심스럽게 만들어 COC, 여포 액액 및 세포의 덩어리를 포함하는 여포 함량을 방출합니다.COC를 식별하고 적분 무결성, 조나 펠루시다 무결성 및 세포질의 균질성을 검사합니다. 이러한 기준이 충족되면 P20 파이펫으로 COC를 흡인합니다. M199D 시로사미드에서 격리된 COC를 레이스하고 30분 동안 격리 절차를 계속합니다.이전에 설명한 대로 COC를 선택한 후 60mm 페트리 접시에 M199D 시로스타미드 20마이크로리터로 16방울을 준비하고 건강한 COC 를 각 방울에 넣습니다. 카메라에 부착된 반전 된 현미경을 사용하여 zona pellucida를 제외한 난소 지름을 측정하십시오. oocyte의 명확한 시각화를 통해 두 개의 수직 측정을 통해 두 측정의 평균이 100~ 110 마이크로미터 범위 내에 있음을 보장합니다.컴패니언 적혈구로 인해 난모세포의 직경을 정확하게 측정하기가 어려울 수 있다. 직경이 작거나 더 큰 난모세포가 없거나 둥근 난모세포가 없거나 측정할 수 없는 난모세포가 있는 COC를 폐기해야 합니다. 선택한 COC를 M199H 배지가 들어 있는 35mm 접시로 옮기고, 최대 습도가 있는 38.5도 및 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 보관하여 전체 근무 시간이 2시간을 초과하지 않도록 하십시오.선택 및 수집 절차가 완료되면 이전에 준비된 96웰 플레이트의 각 웰의 중심으로 하나의 COC를 전송합니다. 최대 습도가 있는 섭씨 38.5도, 이산화탄소 5%로 5일간 플레이트를 배양하고 격일로 배지를 새로 고칩니다. 배지를 갱신하려면 오래된 배지의 100 마이크로리터를 신선한 긴 IVCO 배지의 100 마이크로리터로 교체하고, 코크스의 이동을 피하기 위해 스테레오 현미경으로 이 작업을 수행합니다.긴 IVCO의 끝에서, COCs 형태를 분석. 적혈구 확장 또는 세포 변성의 흔적이없는 컴팩트 한 적혈구 세포 투자가있는 경우 클래스 하나로 분류하십시오. COC가 적혈구 팽창 또는 세포 변성의 흔적없이 컴팩트 한 적혈구 투자를 하고 하나 이상의 antrum 과 같은 형성을 가진 경우, 클래스 2로 분류합니다.클래스 3 COCs, 적운 확장의 흔적없이 적수 세포의 여러 층을 보여, 적운 세포의 외부 층에 일부 분해 된 세포와 아니 antrum 같은 형성. COC를 난구 표면의 50% 이상까지 확장하는 적수 세포의 풍부한 손실뿐만 아니라 세포 변성 및 세포 이물질의 징후를 보이는 경우 4급으로 분류합니다. 긴 IVCO의 끝에서 COC의 총 형태가 변경됩니다.그리고 4개의 클래스는 적수 세포의 외관에 기초하여 확인되었다. 전반적으로, 5개의 생물학 복제에 있는 74개의 난낭을 분석하였고, 그 중 9.45%는 추가 평가에서 폐기되었습니다. 1, 2, 3등급은 건강한 것으로 판단되었으며, 4등급은 난낭을 둘러싼 적혈구의 완전한 층이 없는 등 변성의 명확한 징후를 보였다.이러한 COC는 향후 IVP 설정에서 다운스트림 절차를 거치지 않는 것으로 간주되었습니다. 긴 IVCO의 끝에 있는 메이오틱 단계의 평가는 난동세포의 상당히 높은 비율이 미숙한 단계에서 체포된 채로 남아 있는 것을 보여주었으며, 크로마틴은 여전히 GV 내에 동봉되어 있습니다. GV 내의 크로마틴 응축이 능력의 이득의 마커로 조사되었을 때, 크로마틴 구성의 전이보다 응축된 단계, 즉 GV 2 및 GV 3로의 전환은 난모세포의 59%에서 관찰되었다. 작은 백분율은 메타상 1 단계, 또는 변성에 도달 하는 meiosis 를 재개.이러한 결과는 L-IVCO 배양이 5일 동안 메이오틱 재개를 방지하면서 난소 세포의 생존가능성을 지원한다는 것을 보여줍니다. 긴 IVCO의 끝에서, COC는 체외 배아 생산, 즉 체외 성숙, 수정 및 배아 문화의 다운스트림 절차에 사용될 수 있다. 이러한 단계는 난마세포가 더 높은 발달 능력을 획득했다는 개념 증명을 제공하는 데 필요합니다.지렬한 난모세포의 양을 증가시키는 잠재력을 보유하는 것 외에도, 긴 IVCO 배양 시스템은 유능한 게임테의 형성을 조절하는 세포 및 분자 공정을 해부하는 데 관심이 있는 과학자들을 위한 도구입니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

연구

발생학

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

인간 양막의 다른 해부학 적 영역에서 상피 세포의 시험관 내 배양

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...