Name: in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle
Uploaded: 2020-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 og UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Eggstokkene ble samlet inn fra 4 til 8 år gamle Holstein melkekyr gjenvunnet ved det lokale slakteriet (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italia).
1. Forberedelse av medier
MERK: Alle medier må være forberedt minst fire timer før bruk. Natriumbikarbonatbufret media inkuberes ved 38,5 °C og 5 % CO2 i luft, maksimal luftfuktighet. HEPES-bufret media opprettholdes ved 38,5 °C i termostatovn.
<ol><li>Lang in vitro kultur av oocyte...

<ol>
	<li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Oocytes+in+Vitro.">Maturation of Oocytes in Vitro.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).</li><li>Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+communications+regulate+chromatin+remodeling+during+bovine+oocyte+growth+and+differentiation+through+cAMP-dependent+mechanism(s).">Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s).</a> Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).</li><li>McLaughlin, M., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+bovine+primordial+follicles+is+promoted+by+activin+and+FSH+within+a+two-step+serum-free+culture+system.">Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system.</a> Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).</li><li>Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achievements+and+unmet+promises+of+assisted+reproduction+technologies+in+large+animals:+a+per-sonal+perspective.">Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective.</a> Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).</li><li>Luciano, A. M., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+in+vitro+maturation+of+oocytes:+a+matter+of+follicular+differentiation.">Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation.</a> Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).</li><li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-produced+bovine+embryos:+dealing+with+the+warts.">In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts.</a> Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).</li><li>Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+reserve+of+primordial+follicles+and+the+dynamic+reserve+of+antral+growing+follicles:+what+is+the+link.">The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link.</a> Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).</li><li>Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+of+follicles+in+the+ovary+of+the+cow.">Growth rates of follicles in the ovary of the cow.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).</li><li>Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+ultrastructure+in+bovine+primordial+to+early+tertiary+follicles.">Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles.</a> Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).</li><li>Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+developmental+competence+of+bovine+oocytes+derived+from+different+categories+of+antral+follicles.">Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles.</a> Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).</li><li>Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+and+follicular+morphology+as+determining+characteristics+for+developmental+competence+in+bovine+oocytes.">Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).</li><li>Harada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+from+early+antral+follicles+grow+to+meiotic+competence+in+vitro:+effect+of+FSH+and+hypoxanthine.">Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine.</a> Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).</li><li>Hirao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+and+development+of+bovine+oocyte-granulosa+cell+complexes+on+the+flat+substratum:+effects+of+high+polyvinylpyrrolidone+concentration+in+culture+medium.">In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).</li><li>Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+meiotic+competence+of+bovine+oocytes+originating+from+early+antral+ovarian+follicles.">Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles.</a> Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).</li><li>Taketsuru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+in+secondary+follicles+grow+in+medium+containing+bovine+plasma+after+vitrification.">Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+supports+in+vitro+development+of+bovine+early+antral+follicles.">Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles.</a> Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+promote+bovine+oocyte+growth+and+connection+with+granulosa+cells.">Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells.</a> Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+to+live+young+from+bovine+small+oocytes+after+growth,+maturation+and+fertilization+in+vitro.">Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro.</a> Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).</li><li>Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PDE3A+sustains+meiotic+arrest+and+gap+junction+of+bovine+growing+oocytes+in+in+vitro+growth+culture.">Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture.</a> Theriogenology. 118, 110-118 (2018).</li><li>Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+chromatin+remodeling+in+germinal+vesicle+bovine+oocytes:+interplay+with+gap+junction+functionality+and+developmental+competence.">Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+morphology+and+transcriptional+silencing+in+relation+to+chromatin+remodeling+during+the+final+phases+of+bovine+oocyte+growth.">Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+cumulus+cell+gene+expression+indicate+the+benefit+of+a+pre-maturation+step+to+improve+in-vitro+bovine+embryo+production.">Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production.</a> Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+interact+with+natriuretic+peptide+C+to+delay+nuclear+maturation,+to+maintain+oocyte-cumulus+communication+and+to+improve+the+quality+of+in+vitro-produced+embryos+in+cattle.">Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle.</a> Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+control+of+oocyte+large-scale+chromatin+configuration+in+different+cattle+breeds.">Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds.</a> Theriogenology. 141, 146-152 (2020).</li><li>Franciosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+precursor+C+delays+meiotic+resumption+and+sustains+gap+junction-mediated+communication+in+bovine+cumulus-enclosed+oocytes.">Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes.</a> Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+levels+of+intracellular+cAMP+on+the+in+vitro+maturation+of+cattle+oocytes+and+their+subsequent+development+following+in+vitro+fertilization.">Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization.</a> Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).</li><li>Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oocyte+quality+on+development+and+transcriptional+activity+in+early+bovine+embryos.">Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos.</a> Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cilostamide+on+gap+junction+communication+dynamics,+chromatin+remodeling,+and+competence+acquisition+in+pig+oocytes+following+parthenogenetic+activation+and+nuclear+transfer.">The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer.</a> Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).</li><li>Shu, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+supports+transcription+and+improves+meiotic+competence+of+growing+bovine+oocytes.">Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes.</a> Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).</li><li>Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrophin+and+steroid+concentrations+in+bovine+follicular+fluid+and+their+relationship+to+follicle+size.">Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).</li><li>Kruip, T. A., Dieleman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+concentrations+in+the+fluid+of+bovine+follicles+relative+to+size,+quality+and+stage+of+the+oestrus+cycle.">Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle.</a> Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).</li><li>Sakaguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+antral+follicle+count,+steroidogenesis,+and+secretion+of+follicle-stimulating+hormone+and+anti-Mullerian+hormone+during+follicular+growth+in+cattle.">Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+promote+the+acquisition+of+maturation+competence+in+bovine+oocytes.">Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes.</a> Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).</li><li>Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+actions+and+the+ovary.">Androgen actions and the ovary.</a> Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).</li><li>Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+inhibits+large+granulosa+cell+apoptosis+by+stimulating+progesterone+synthesis+and+regulating+the+distribution+of+intracellular+free+calcium.">Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium.</a> Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).</li><li>Gordon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).</li><li>Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+serum-free+culture+system+supports+development+of+human+oocytes+from+primordial+follicles+in+the+presence+of+activin.">A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin.</a> Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocyte+diameter+in+relation+to+maturational+competence+and+transcriptional+activity.">Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).</li></ol>

Her beskriver vi et kultursystem for voksende oocytter som fremmer oocyteutvikling i 5 dager ved å støtte deres levedyktighet og forhindre meiotisk gjenopptakelse. Dette siste aspektet er av største betydning for å tillate fortsatt vekst og differensiering som er nødvendig for å overdra oocytten med meiotisk og embryonisk utviklingskompetanse2,20, som ellers ville bli blokkert av en for tidlig gjenopptakelse av den meiotiske divisjonen.
<p class="jove_c...

I løpet av den reproduktive levetiden frigjøres bare en minimal brøkdel av oocytter som er tilstede i eggstokken, i egglederne ved eggløsning, og er tilgjengelige for å bli befruktet og utvikle seg til et levedyktig embryo1. På den annen side gjennomgår de fleste oocytes i en eggstokk atresi og blir aldri eggløsning. In vitro embryoproduksjon (IVP) teknologier har forsøkt å øke utnyttelsen av ovarian reserve2,3. Så langt har slike teknologier tillatt intervensjoner av fruktbarhet bevaring, utvalg programmer i husdyr, og bevaring av truede arter. Likevel bruker de fleste protokoller oocytes som i utgangspunktet har fullført vekstfasen i antral ovariefollikelen, og dermed kalles fullvoksne oocytter. I storfe, hvor IVP-teknologier er mye brukt, når fullvoksne oocytter en endelig diameter på ca. 120 μm og samles inn fra follikler som strekker seg fra 2 til 8 mm i diameter (middels antral follikler)1. Ved isolasjon fra folliklene blir slike oocytter in vitro modnet og befruktet. Zygotene blir deretter dyrket opp til blastocyst scenen og enten overført til en mottaker eller kryopreservert. Hos storfe, så vel som i mange andre arter, til tross for potensialet som tilbys av IVP, ble antall in vitro produsert embryo per ku ikke i stor grad bedre de siste 40 årene. Dette skyldes delvis det begrensede antallet fullvoksne oocytter som fyller en eggstokk på et gitt tidspunkt som kan hentes og utsettes for standard IVPteknikker 4,5,6.
Oocytes omsluttet i tidlig antral follikler, det vil si de folliklene som er mindre enn 2 mm i diameter, representerer en potensiell kilde som skal brukes i fruktbarhet bevaring programmer7 , som en eggstokk omtrent inneholder 10 ganger mer tidlig antral follikler enn middels antral8. Imidlertid er disse oocytes fortsatt i vekstfasen og har ennå ikke nådd den fullvoksne scenen9. Som sådan er de fortsatt transkripsjonelt aktive, produserer mRNAs som vil bli lagret for senere utviklingstrinn, og har ennå ikke gjennomgått all differensieringsprosessen som kreves for å overdra oocytter med evnen til spontant å gjenoppta og fullføre meiose jeg en gang isolert fra follikulærtrom 10,11. Derfor kan de ikke sendes direkte til standard IN vitro modningsprotokoller (IVM), men de krever en ekstra periode med kultur som ville tillate dem å fullføre vekstfasen og skille riktig.
Overgangen fra den voksende til det fullvoksne scenen, som hos storfe oppstår når follikkelen utvikler seg fra tidlig antral til middels antralstadium, er et av de kritiske trinnene under oocyteutvikling. I storfe, flere studier forsøkte å rekafulere disse hendelsene in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Men til dags dato ingen pålitelige protokoller har blitt utviklet og bare begrenset suksess har blitt rapportert. Ifølge tidligere studier20utgjør disse voksende oocytes en homogen befolkning. Foruten å være transkripsjonelt aktiv, er deres kromatin spredt i germinal vesikkelen (GV), i en konfigurasjon som heter GV02,21. Omvendt er befolkningen av fullvoksne oocytter hentet fra middels antrale follikler mer heterogen, en tilstand som speiles av de ulike gradene av kromatinkomprimering (GV1, GV2 og GV3) som kan observeres20. Blant disse har tidligere data vist at GV2 og GV3 oocytes er samlet preget av en bedre kvalitet og høyere embryonisk utviklingskompetanse20,,21,,22,,23,,24.
Fra de ovennevnte observasjonene beskriver vi her et 5-dagers langt kultursystem av oocytter (L-IVCO) som tillater differensiering av oocytter isolert som cumulus-oocyte komplekser (COCer) fra tidlige antral follikler. Denne kulturstrategien har utviklet seg fra 10 år lange studier utført i vårt laboratorium og røtter sin grunn på den tidligere utviklede 24-48 timer in vitro oocyte kultur (IVCO)2,premetningssystemer23,,25 og sink tilskudd under oocyte kultur . En kombinasjon av follikkelstimulerende hormon (FSH) og en fosfodiesterase-3 (PDE3) hemmer, i stand til å forbedre cumulus-oocytekommunikasjon 2, hindre tidlig meiotisk gjenopptakelse2, og støtte oocyte vekst2 ble brukt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:215px;">4-well dishes</td>
			<td style="width:127px;">Nunclon</td>
			<td style="width:123px;">179830</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:215px;">96-well dish</td>
			<td style="width:127px;">Becton Dickinson Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">356649</td>
			<td>BioCoat&#8482; Collagen I</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell culture water</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cilostamide</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>C7971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cysteamine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td>Camera DS-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glutamax Supplement</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gonal F</td>
			<td style="width:127px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Heparin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hepes</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Vacuum pump</td>
			<td>Cook-IVF</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Sanyo</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M3769</td>
			<td style="width:171px;">Powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2520</td>
			<td>Powder for M199-D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Corp</td>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td style="width:123px;">Eclipse E 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicilin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>360k molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Progesterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium choride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Testosterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">H1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle

Den begrensede reserven av modne, befruktbare oocytter representerer en stor barriere for suksessen til assistert reproduksjon hos pattedyr. Tatt i forhold til at i løpet av reproduktiv levetid bare ca 1% av oocytes i en eggstokk modne og eggløsning, flere teknikker har blitt utviklet for å øke utnyttelsen av ovarian reserve til den voksende befolkningen av ikke-ovulatory follikler. Slike teknologier har tillatt intervensjoner av fruktbarhet bevaring, utvalg programmer i husdyr, og bevaring av truede arter. Imidlertid er det enorme potensialet i ovariereserven fortsatt i stor grad uutnyttet. Hos kyr, for eksempel, noen forsøk har blitt gjort for å støtte in vitro kultur av oocytes på bestemte utviklingsstadier, men effektive og pålitelige protokoller har ennå ikke blitt utviklet. Her beskriver vi et kultursystem som reproduserer de fysiologiske forholdene i det tilsvarende follikulære stadiet, definert for å utvikle in vitro voksende oocytter samlet fra storfe tidlig antrale follikler til det fullvoksne stadiet, tilsvarende den middels antral follikkel in vivo. En kombinasjon av hormoner og en fosfodiesterase 3-hemmer ble brukt til å forhindre tidlig meiotisk gjenopptakelse og for å veilede oocytes differensiering.

På slutten av L-IVCO ble bruttomorfologien til COCene endret og 4 klasser ble identifisert basert på utseendet til cumulus-cellene, som vist i figur 2. Basert på de morfologiske kriteriene som vanligvis ble vedtatt for å velge sunne COCer11,26,27,ble klasse 1, 2 og 3 dømt sunn, mens klasse 4, som viste klare tegn på degenerasjon som fravær av komplette lag av cumulus celler rundt oocytes, ble...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Vi beskriver prosedyrene for isolering av voksende oocytter fra ovariefollikler i tidlige utviklingsstadier, samt oppsettet av et in vitro kultursystem som kan støtte vekst og differensiering opp til det fullvoksne stadiet.

In Vitro Kultur Strategi for Oocytes fra Tidlig Antral Follikkel i Storfe

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

I denne videoprotokollen demonstrerer vi i detalj et kultursystem for dyrking av storfeoocytter. Systemet støtter oocytes levedyktighet i kultur i opptil fem dager og gir mulighet for deres differensiering. Ved hjelp av dette kultursystemet kan oocytter samlet inn fra små antralsekkkler, som vanligvis ikke brukes i standardprotokoller for in vitro i produksjonen, dyrkes for å øke tilgjengeligheten av befruktbare gametes.Denne utnyttelsen av det bredere reservatet, kan gi nye alternativer for genetisk berging av truede arter, av storfefamilien, eller av lokale raser i fare for genetisk erosjon. Til å begynne med, forberede 15 milliliter av grunnleggende kulturmedium og supplere det i henhold til manuskriptretninger. Deretter forbereder du tre milliliter med å holde medium ved å legge til fem mikromolarcilostamid til det grunnleggende kulturmediet og hell det i en 35 millimeter Petri-tallerken.Forbered lenge IVCO medium ved å supplere grunnleggende kulturmedium i henhold til manuskriptretninger. Tilsett 200 mikroliter med langt IVCO-medium til hver brønn av en 96-godt belagt plate. Fyll deretter de fire kantene med sterilt vann for å kompensere for fordampning og for å opprettholde passende fuktighet under kulturen.Inkuber 96-brønnplaten og holdemediet på 38,5 grader celsius og 5% karbondioksid med maksimal fuktighet. Vask eggstokkene fire ganger i steril saltvann, vedlikeholdt ved 26 grader celsius. Deretter aspirerer alle follikler som er mer enn to millimeter i diameter, med en 18 gauge nål koblet til en aspirasjonspumpe.Snøre de aspirerte eggstokkene i et beger med steril saltvann opprettholdt ved 26 grader celsius. Plasser en eggstokk om gangen på et sterilt PTFE skjærebrett, og bruk et kirurgisk nummer 22 blad for å kutte skiver av ovariebark som er 1,5 til to millimeter tykk, og parallelt med organets hovedakse. Snøre skiver av ovariebark i et sterilt glass Petriskål, med dissekeringsmediet på en varm tallerken, ved 38,5 grader celsius.Lace en ovarian cortex skive i en 60 millimeter glass Petriskål, med to til tre milliliter M199D under et disseksjonmikroskop, velg folliklene som er mellom 5 og to millimeter. Identifiser de sunne ikke-atretiske folliklene under stereomikroskopet, ved å observere morfologiske parametere, for eksempel et jevnt lyst gjennomsiktig utseende, omfattende vaskularisering og et vanlig granulosalag. Mens atretiske follikler har et grått ugjennomsiktig utseende, og er dårlig vaskularisert, med en mørk COC inne.Kast atretikafollikler og behandle alle de andre. Bruk det kirurgiske bladet til å fjerne eggstokkvevet rundt follikkelen på den ene siden, til det blir utsatt. Bruk deretter en 26 gauge nål for å forsiktig lage en spalte i den eksponerte follikkelveggen, som vil frigjøre follikulært innhold som består av COC, follikulær væske og klumper av celler.Identifiser COC og undersøke det for cumulus integritet, zona pellucida integritet og homogenitet av cytoplasma. Hvis disse kriteriene er oppfylt, aspirere COC med en P20 pipette. Snøre den isolerte COC i M199D cilostamide, og fortsett isolasjonsprosedyren i 30 minutter.Etter å ha valgt COCer, som tidligere beskrevet, forberede 16 dråper med 20 mikroliter M199D cilostamide i en 60 millimeter Petri skål, og plassere en sunn COC i hver dråpe. Bruk et omvendt mikroskop festet til et kamera for å måle oocytediameteren, unntatt zona pellucida. Med en klar visualisering av oocytten, gjør to vinkelrett målinger, forsikrer at gjennomsnittet av de to målingene er innenfor et område på 100 til 110 mikrometer.Det kan være vanskelig å nøyaktig måle oocytes diameter, på grunn av følgesvenn cumulus celler. CoCer som har oocytter med mindre eller større diameter, eller som ikke har en avrundet oocyte, eller de med oocytes som ikke er målbare, bør kastes. Overfør de valgte COCene til en 35 millimeter tallerken som inneholder M199H-medium, og hold dem i inkubatoren ved 38,5 grader celsius og 5% karbondioksid med maksimal fuktighet, sørg for at den totale arbeidstiden ikke overstiger to timer.Når utvalgs- og innsamlingsprosedyrene er fullført, overfører du en COC til midten av hver brønn av den tidligere forberedte 96-brønnplaten. Inkuber platen i fem dager ved 38,5 grader celsius og 5% karbondioksid med maksimal fuktighet, oppdater mediet annenhver dag. For å fornye mediet, erstatt 100 mikroliter gammelt medium med 100 mikroliter friskt langt IVCO-medium, gjør dette under stereomikroskopet for å unngå å flytte COCene.På slutten av den lange IVCO, analysere COCs morfologi. Hvis de har en kompakt cumulus celle investering uten tegn til cumulus ekspansjon, eller celle degenerasjon, klassifisere dem som klasse en. Hvis COCene har en kompakt cumulus celleinvestering uten tegn til cumulus ekspansjon eller celledegenerasjon, og med en eller flere antrum-lignende formasjoner, klassifisere dem som klasse to.Klasse tre COCer, viser flere lag med cumulus celler uten tegn til cumulus ekspansjon, noen disaggregated celler i det ytre laget av cumulus celler og ingen antrum-lignende formasjon. Klassifisere COCene som klasse fire hvis de viser rikelig tap av cumulus celler som strekker seg for mer enn 50% av oocyte overflaten, samt tegn på celledegenerasjon og celle rusk. På slutten av lang IVCO endres brutto morfologien til COC.Og fire klasser ble identifisert basert på utseendet til cumulus cellene. Totalt ble 74 oocytes i fem biologiske replikeringer analysert, hvorav 9,45% ble forkastet fra videre evaluering. Klasser en, to og tre ble dømt sunn, mens klasse fire viste klare tegn på degenerasjon, for eksempel fravær av komplette lag av cumulus celler rundt oocytes.Disse COCene ble ansett som uegnet til å gjennomgå nedstrøms prosedyrer i en potensiell IVP-innstilling. Vurdering av det meiotiske stadiet på slutten av den lange IVCO viste at en betydelig høyere prosentandel av oocytter forble arrestert på umoden stadium, med kromatin fortsatt omsluttet av GV. Når kromatinkondensasjon i GV ble undersøkt som en markør for kompetansegevinst, ble overgangen av kromatinkonfigurasjonen til mer kondenserte stadier, nemlig GV to og GV tre, observert i 59% av oocytes. En liten prosentandel gjenopptok meiose som nådde metafase ett stadium, eller degenerasjon.Disse resultatene viser at L-IVCO-kulturen støtter oocyte levedyktigheten, samtidig som den forhindrer meiotisk gjenopptakelse i fem dager. På slutten av den lange IVCO kan COC-ene brukes i nedstrøms prosedyrer for in vitro embryoproduksjon, nemlig in vitro modning, befruktning og embryokultur. Disse trinnene er nødvendige for å gi bevis på at oocytten har fått en høyere utviklingskompetanse.Foruten å holde potensialet for å øke mengden befruktbare oocytter, er det lange IVCO kultursystemet et verktøy for forskere som er interessert i å dissekere cellulære og molekylære prosesser som regulerer dannelsen av en kompetent gamete.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forstå Tidlig organogenesis hjelp av en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering Protocol i<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic Approach for Assessing Dannelse av nevronkoblinger i en Co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcellelignende<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale eksplantater å studere Tidlig Neural utviklingstrekk<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolering og karakterisering av Mouse Antral Oocytter Basert på nukleolært Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av mobilnettet elektrisk aktivitet i sebrafisk tidlig embryo og svulster

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In vitro kultur av epitelceller fra ulike anatomiske regioner av Human fostervann membran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...