Name: in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle
Uploaded: 2020-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

Эта работа была поддержана Регион Ломбардия PSR INNOVA N.201801061529 и UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Яичники были собраны от 4 до 8 лет Гольштейн молочных коров, восстановленных на местной скотобойне (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Италия).
1. Подготовка средств массовой информации
ПРИМЕЧАНИЕ: Все средства массовой информации должны быть подготовлены по край...

<ol>
	<li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Oocytes+in+Vitro.">Maturation of Oocytes in Vitro.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).</li><li>Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+communications+regulate+chromatin+remodeling+during+bovine+oocyte+growth+and+differentiation+through+cAMP-dependent+mechanism(s).">Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s).</a> Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).</li><li>McLaughlin, M., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+bovine+primordial+follicles+is+promoted+by+activin+and+FSH+within+a+two-step+serum-free+culture+system.">Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system.</a> Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).</li><li>Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achievements+and+unmet+promises+of+assisted+reproduction+technologies+in+large+animals:+a+per-sonal+perspective.">Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective.</a> Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).</li><li>Luciano, A. M., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+in+vitro+maturation+of+oocytes:+a+matter+of+follicular+differentiation.">Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation.</a> Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).</li><li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-produced+bovine+embryos:+dealing+with+the+warts.">In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts.</a> Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).</li><li>Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+reserve+of+primordial+follicles+and+the+dynamic+reserve+of+antral+growing+follicles:+what+is+the+link.">The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link.</a> Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).</li><li>Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+of+follicles+in+the+ovary+of+the+cow.">Growth rates of follicles in the ovary of the cow.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).</li><li>Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+ultrastructure+in+bovine+primordial+to+early+tertiary+follicles.">Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles.</a> Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).</li><li>Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+developmental+competence+of+bovine+oocytes+derived+from+different+categories+of+antral+follicles.">Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles.</a> Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).</li><li>Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+and+follicular+morphology+as+determining+characteristics+for+developmental+competence+in+bovine+oocytes.">Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).</li><li>Harada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+from+early+antral+follicles+grow+to+meiotic+competence+in+vitro:+effect+of+FSH+and+hypoxanthine.">Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine.</a> Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).</li><li>Hirao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+and+development+of+bovine+oocyte-granulosa+cell+complexes+on+the+flat+substratum:+effects+of+high+polyvinylpyrrolidone+concentration+in+culture+medium.">In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).</li><li>Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+meiotic+competence+of+bovine+oocytes+originating+from+early+antral+ovarian+follicles.">Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles.</a> Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).</li><li>Taketsuru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+in+secondary+follicles+grow+in+medium+containing+bovine+plasma+after+vitrification.">Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+supports+in+vitro+development+of+bovine+early+antral+follicles.">Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles.</a> Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+promote+bovine+oocyte+growth+and+connection+with+granulosa+cells.">Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells.</a> Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+to+live+young+from+bovine+small+oocytes+after+growth,+maturation+and+fertilization+in+vitro.">Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro.</a> Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).</li><li>Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PDE3A+sustains+meiotic+arrest+and+gap+junction+of+bovine+growing+oocytes+in+in+vitro+growth+culture.">Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture.</a> Theriogenology. 118, 110-118 (2018).</li><li>Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+chromatin+remodeling+in+germinal+vesicle+bovine+oocytes:+interplay+with+gap+junction+functionality+and+developmental+competence.">Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+morphology+and+transcriptional+silencing+in+relation+to+chromatin+remodeling+during+the+final+phases+of+bovine+oocyte+growth.">Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+cumulus+cell+gene+expression+indicate+the+benefit+of+a+pre-maturation+step+to+improve+in-vitro+bovine+embryo+production.">Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production.</a> Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+interact+with+natriuretic+peptide+C+to+delay+nuclear+maturation,+to+maintain+oocyte-cumulus+communication+and+to+improve+the+quality+of+in+vitro-produced+embryos+in+cattle.">Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle.</a> Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+control+of+oocyte+large-scale+chromatin+configuration+in+different+cattle+breeds.">Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds.</a> Theriogenology. 141, 146-152 (2020).</li><li>Franciosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+precursor+C+delays+meiotic+resumption+and+sustains+gap+junction-mediated+communication+in+bovine+cumulus-enclosed+oocytes.">Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes.</a> Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+levels+of+intracellular+cAMP+on+the+in+vitro+maturation+of+cattle+oocytes+and+their+subsequent+development+following+in+vitro+fertilization.">Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization.</a> Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).</li><li>Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oocyte+quality+on+development+and+transcriptional+activity+in+early+bovine+embryos.">Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos.</a> Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cilostamide+on+gap+junction+communication+dynamics,+chromatin+remodeling,+and+competence+acquisition+in+pig+oocytes+following+parthenogenetic+activation+and+nuclear+transfer.">The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer.</a> Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).</li><li>Shu, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+supports+transcription+and+improves+meiotic+competence+of+growing+bovine+oocytes.">Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes.</a> Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).</li><li>Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrophin+and+steroid+concentrations+in+bovine+follicular+fluid+and+their+relationship+to+follicle+size.">Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).</li><li>Kruip, T. A., Dieleman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+concentrations+in+the+fluid+of+bovine+follicles+relative+to+size,+quality+and+stage+of+the+oestrus+cycle.">Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle.</a> Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).</li><li>Sakaguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+antral+follicle+count,+steroidogenesis,+and+secretion+of+follicle-stimulating+hormone+and+anti-Mullerian+hormone+during+follicular+growth+in+cattle.">Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+promote+the+acquisition+of+maturation+competence+in+bovine+oocytes.">Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes.</a> Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).</li><li>Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+actions+and+the+ovary.">Androgen actions and the ovary.</a> Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).</li><li>Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+inhibits+large+granulosa+cell+apoptosis+by+stimulating+progesterone+synthesis+and+regulating+the+distribution+of+intracellular+free+calcium.">Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium.</a> Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).</li><li>Gordon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).</li><li>Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+serum-free+culture+system+supports+development+of+human+oocytes+from+primordial+follicles+in+the+presence+of+activin.">A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin.</a> Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocyte+diameter+in+relation+to+maturational+competence+and+transcriptional+activity.">Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).</li></ol>

Здесь мы описываем культурную систему выращивания яйцеклеток, которая способствует развитию яйцеклеток в течение 5 дней, поддерживая их жизнеспособность и предотвращая мейотические возобновления. Этот последний аспект имеет первостепенное значение, чтобы обеспечить дальнейший рост...

Во время репродуктивной жизни, только минимальная доля яйцеклеток, которые присутствуют в яичнике зрелые, высвобождаются в фаллопиевых труб после овуляции, и доступны для оплодотворения и развиваться в жизнеспособный эмбрион1. С другой стороны, большинство яйцеклеток в яичнике проходят атрезию и никогда не овуляции. Технологии производства эмбрионов in vitro (IVP) пытались увеличить эксплуатацию резерва яичников2,,3. До сих пор такие технологии позволяли мероприятия по сохранению плодородия, программам отбора скота и сохранению исчезающих видов. Тем не менее, большинство протоколов использовать яйцеклетки, которые в основном завершили фазу роста в антрал яичников фолликула, и, следовательно, называются полностью выращенных яйцеклеток. В крупного рогатого скота, где технологии IVP широко используются, полностью выращенные яйцеклетки достигают конечного диаметра около 120 мкм и собираются из фолликулов, которые охватывают от 2 до 8 мм в диаметре (средние антрал фолликулы)1. После изоляции от фолликулов такие яйцеклетки созревают и оплодотворяются в пробирке. Зиготы затем культурны до стадии бластоцист и либо переданы получателю или криоконсервированы. У крупного рогатого скота, как и у многих других видов, несмотря на потенциал, предлагаемый IVP, количество эмбриона в пробирке на корову в значительной степени не улучшась в течение последних 40 лет. Отчасти это связано с ограниченным числом полностью выращенных яйцеклеток, которые населяют яичник в данный момент времени, которые могут быть извлечены и подвергнуты стандартным методам IVP4,,5,,6.
Ооциты, заключенные в ранние антрал фолликулы, т.е. те фолликулы диаметром менее 2 мм, представляют собой потенциальный источник, который будет использоваться впрограммах сохранения плодородия 7, так как яичник примерно содержит в 10 раз больше ранних антрал-фолликулов, чем среднийантрал 8. Тем не менее, эти яйцеклетки все еще находятся в фазе роста и еще не достигли полностью выращенной стадии9. Таким образом, они по-прежнему транскрипционно активны, производя mRNAs, которые будут храниться для более поздних шагов развития, и еще не прошли весь процесс дифференциации, необходимые для придать яйцеклетки с возможностью спонтанного возобновления и завершения мейоза я когда-то изолированы от фолликулярногоотсека 10,11. Поэтому они не могут быть непосредственно представлены к стандартным протоколам созревания in vitro (IVM), но они требуют дополнительного периода культуры, который позволил бы им завершить фазу роста и правильно дифференцировать.
Переход от выращивания к полностью выращенной стадии, которая у крупного рогатого скота происходит, когда фолликул развивается от ранней антраля к средней антральную стадию, является одним из важнейших шагов во время развития яйцеклеток. В крупного рогатого скота, несколько исследований пытались повторить эти события впробирке2,12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,19. Однако до настоящего времени никаких надежных протоколов не разрабатывалось, и сообщалось лишь об ограниченном успехе. Согласно предыдущим исследованиям20, эти растущие яйцеклетки представляют собой однородную популяцию. Помимо транскрипционной активной, их хроматин рассеивается в зародышевой везикуле (GV), в конфигурации, которая называется GV02,21. И наоборот, популяция полностью выращенных яйцеклеток, полученных из средних антрал фолликулов, является более неоднородной, состояние, которое отражается в различных степенях уплотнения хроматина (GV1, GV2 и GV3), которыеможно наблюдать 20. Среди них, предыдущие данные показали, что GV2 и GV3 ооцитов в целом характеризуется лучшим качеством и более высокойэмбриональной компетенции развития 20,21,22,23,24.
Начиная с вышеуказанных наблюдений, здесь мы описываем 5-дней культурную систему ооцитов (L-IVCO), которая позволяет дифференцировать ооциты, изолированные как кумулятиво-ооцитные комплексы (COCs) от ранних антралальных фолликулов. Эта стратегия культуры развивалась из 10 лет исследований, проведенных в нашей лаборатории и корни его землю на ранее разработанных 24-48 часов в пробирке ооцитов культуры (IVCO)2,недоношенных систем 23,25 и цинк добавок во время культуры яйцеклеток . Использовалась комбинация фолликулостимулирующего гормона (ФФГ) и ингибитора фосфодиэстеразы-3 (PDE3), способного усилить кумулятивно-ооцитнуюсвязь 2, предотвратитьнесвоевременное межиоптическое возобновление 2,атакже поддержать рост яйцеклеток 2.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:215px;">4-well dishes</td>
			<td style="width:127px;">Nunclon</td>
			<td style="width:123px;">179830</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:215px;">96-well dish</td>
			<td style="width:127px;">Becton Dickinson Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">356649</td>
			<td>BioCoat&#8482; Collagen I</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell culture water</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cilostamide</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>C7971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cysteamine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td>Camera DS-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glutamax Supplement</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gonal F</td>
			<td style="width:127px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Heparin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hepes</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Vacuum pump</td>
			<td>Cook-IVF</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Sanyo</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M3769</td>
			<td style="width:171px;">Powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2520</td>
			<td>Powder for M199-D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Corp</td>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td style="width:123px;">Eclipse E 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicilin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>360k molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Progesterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium choride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Testosterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">H1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle

Ограниченный резерв зрелых, удобренных яйцеклеток представляет собой основной барьер для успеха вспомогательной репродукции у млекопитающих. Учитывая, что в период репродуктивной жизни только около 1% яйцеклеток в яичниках зрелых и овуляции, несколько методов были разработаны для увеличения эксплуатации яичников резерва для растущей популяции неовуляторных фолликулов. Такие технологии позволили проведить сохранение плодородия, программы отбора скота и сохранения исчезающих видов. Тем не менее, огромный потенциал резерва яичников по-прежнему в значительной степени неэксплуатируются. У коров, например, предпринимались некоторые попытки поддержать культуру экстракорпорального использования яйцеклеток на конкретных стадиях развития, однако эффективные и надежные протоколы еще не разработаны. Здесь мы описываем культурную систему, которая воспроизводит физиологические условия соответствующей фолликулярной стадии, определяемой для развития в пробирке растущих яйцеклеток, собранных из ранних антральных фолликулов крупного рогатого скота на полностью выращенную стадию, соответствующую среднему антральную фолликулу in vivo. Сочетание гормонов и ингибитора фосфодиэстеразы 3 было использовано для предотвращения несвоевременного мейотического возобновления и для руководства дифференциацией яйцеклеток.

В конце L-IVCO, валовая морфология COCs изменилась и 4 класса были определены на основе внешнего вида кучевых клеток, как показано на рисунке 2. Основываясь на морфологических критериев, обычнопринятых для выбора здоровыхCOCs 11,26,2...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Мы описываем процедуры изоляции растущих яйцеклеток от фолликулов яичников на ранних стадиях развития, а также установку системы культуры in vitro, которая может поддерживать рост и дифференциацию до полностью выращенной стадии.

In Vitro Культурная стратегия для Oocytes от раннего антрального фолликула в крупного рогатого скота

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

В этом видео-протоколе мы подробно демонстрируем культурную систему выращивания ооцитов крупного рогатого скота. Система поддерживает жизнеспособность яйцеклеток в культуре на срок до пяти дней и допускает их дифференциацию. Используя эту культурную систему, яйцеклетки, собранные из небольших антрал фолликулов, которые обычно не используются в стандартных протоколах для in vitro в производстве, могут быть выращены, чтобы увеличить доступность оплодотворенных готей.Такая эксплуатация более широкого заповедника может предоставить новые возможности для генетического спасения видов, на которые угрожает опасность генетической эрозии, или семейство бычьих пород или местных пород. Для начала подготовьте 15 миллилитров базовой культурной среды и дополните ее в соответствии с рукописными указаниями. Затем приготовьте три миллилитров среды, добавив пять микромоляных цилостамида в базовую культурную среду и вылейте его в 35-миллиметровую чашку Петри.Подготовьтесь к длинной среде IVCO, дополнив базовую культурную среду в соответствии с рукописными указаниями. Добавьте 200 микролитров длинной среды IVCO к каждому колодец 96-хорошо покрытой пластины. Затем заполните четыре края стерильной водой, чтобы компенсировать испарение и поддерживать соответствующую влажность во время культуры.Инкубировать 96-хорошо пластины и проведения среды при 38,5 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с максимальной влажностью. Вымойте яичники четыре раза в стерильном солевом растворе, поддерживаемом при 26 градусах по Цельсию. Затем аспирировать все фолликулы, которые более двух миллиметров в диаметре, с 18 калибровочных иглы подключены к аспирации насоса.Кружева аспирированных яичников в стакане со стерильным солевым раствором поддерживается на 26 градусов по Цельсию. Поместите один яичник одновременно на стерильную разделольную доску PTFE и используйте хирургическое лезвие номер 22, чтобы сократить ломтики коры яичников толщиной от 1,5 до 2 миллиметров и параллельно основной оси органа. Зашнуйте ломтики коры яичников в стерильной стеклянной чашке Петри, с рассечей среды на теплой тарелке, при 38,5 градусах по Цельсию.Кружева один ломтик коры яичников в 60 миллиметров стекла Петри блюдо, с двумя-тремя миллилитров M199D под микроскопом вскрытия, выберите фолликулы, которые находятся между 5 и 2 миллиметрами. Определите здоровые неатретические фолликулы под стерео микроскопом, наблюдая морфологические параметры, такие как равномерно яркий полупрозрачный вид, обширная васкуляризация и регулярный слой гранулозы. В то время как атретические фолликулы имеют серый непрозрачный вид, и плохо сосудизируется, с темным COC внутри.Отбросьте атретические фолликулы и обработать все остальные. Используйте хирургическое лезвие, чтобы удалить ткани яичников, окружающих фолликул с одной стороны, пока он не подвергается. Затем используйте 26 калибровочных игл, чтобы тщательно сделать щель в открытой стенке фолликула, который выпустит фолликулярное содержание, состоящее из COC, фолликулярной жидкости и скоплений клеток.Определите COC и изучить его на целостность cumulus, zona pellucida целостности и однородности цитоплазмы. Если эти критерии будут выполнены, аспирировать COC с P20 пипетки. Кружева изолированных COC в M199D цилостамида, и продолжить процедуру изоляции в течение 30 минут.После выбора COCs, как описано ранее, подготовить 16 капель с 20 микролитров M199D цилостамида в 60 миллиметров Петри блюдо, и место один здоровый КОК в каждой капле. Используйте перевернутый микроскоп, прикрепленный к камере, чтобы измерить диаметр яйцеклеток, исключая zona pellucida. При четкой визуализации яйцеклетки сделайте два перпендикулярных измерения, убедитесь, что среднее из двух измерений находится в пределах от 100 до 110 микрометров.Это может быть трудно точно измерить диаметр яйцеклеток, из-за сопутствующих кучевых клеток. COCs, которые имеют ооциты с меньшим или большим диаметром, или которые не имеют округлые яйцеклетки, или те, с яйцеклетки, которые не измеримы, должны быть отброшены. Перенесите выбранные COC в 35-миллиметровую тарелку, содержащую M199H среды, и держать их в инкубаторе на 38,5 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с максимальной влажностью, убедитесь, что общее рабочее время не превышает двух часов.Как только процедуры отбора и сбора будут завершены, перенесите один КОК в центр каждой из ранее подготовленных пластин 96-колодец. Инкубировать пластину в течение пяти дней при 38,5 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с максимальной влажностью, обновлять среды через день. Чтобы обновить носитель, заменить 100 микролитров старой среды на 100 микролитров свежей длинной среды IVCO, сделать это под стерео микроскопом, чтобы избежать перемещения COCs.В конце длинного IVCO проанализируйте морфологию COCs. Если они имеют компактный cumulus ячейки инвестиций без признаков расширения cumulus, или клеточной дегенерации, классифицировать их как класс один. Если COCs имеют компактный cumulus ячейки инвестиций без признаков расширения cumulus или клеточной дегенерации, и с одним или более antrum-как образований, классифицировать их как класс два.Класс 3 COCs, показать несколько слоев кучевых клеток без признаков расширения cumulus, некоторые дезагрегированные клетки во внешнем слое кучевых клеток и не antrum-как образование. Классифицировать COCs как класс четыре, если они показывают обильные потери кучевых клеток, простирающихся на более чем 50% поверхности яйцеклетки, а также признаки дегенерации клеток и клеточного мусора. В конце длинного IVCO валовая морфология COC изменена.И четыре класса были определены на основе появления кучевых клеток. Всего было проанализировано 74 яйцеклетки в пяти биологических репликациях, из которых 9,45% были отброшены от дальнейшей оценки. Классы один, два и три были классифицированы здоровыми, в то время как четвертый класс показал явные признаки дегенерации, такие как отсутствие полных слоев кучевых клеток, окружающих ооциты.Эти КОК были сочтены непригодными для прохождения процедур ниже по течению в перспективной установке IVP. Оценка мейотической стадии в конце длинного IVCO показала, что значительно более высокий процент яйцеклеток оставался арестованным на незрелой стадии, при этом хроматин все еще заключен в GV. Когда конденсат хроматина в GV исследовался как маркер усиления компетентности, переход хроматиновой конфигурации к более конденсированным стадиям, а именно GV two и GV three, наблюдался в 59% яйцеклеток. Небольшой процент возобновил мейоз достижения метафазы одной стадии, или дегенерации.Эти результаты показывают, что культура L-IVCO поддерживает жизнеспособность яйцеклеток, предотвращая при этом межиотические возобновления в течение пяти дней. В конце длинного IVCO, COCs могут быть использованы в вниз по течению процедур производства эмбрионов in vitro, а именно, в экстракорпоральном созревании, оплодотворении и культуре эмбрионов. Эти шаги необходимы, чтобы обеспечить доказательство концепции, что яйцеклетки приобрели более высокую компетенцию развития.Помимо использования потенциала увеличения количества оплодотворенных яйцеклеток, длинная система культуры IVCO является инструментом для ученых, которые заинтересованы в вскрытии клеточных и молекулярных процессов, которые регулируют формирование компетентного геймера.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Понимание начале Органогенез, используя упрощенную<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация Протокола в<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Optogenetic подход к оценке Формирование нейронные связи в совместной культуре системы

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Стволовых клеток, как<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбриональные эксплантов для изучения раннего развития, особенности нейронных<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Выделение и характеристика Mouse антрального ооцитов на основе организации хроматина ядрышка

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

В vitro Культура эпителиальных клеток из различных анатомических регионов амниотической Мембраны человека

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...