Name: in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle
Uploaded: 2020-07-08T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 y UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Los ovarios se recogieron de vacas lecheras Holstein de 4 a 8 años recuperadas en el matadero local (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italia).
1. Preparación de medios
NOTA: Todos los medios deben estar preparados al menos cuatro horas antes de su uso. Los medios tamponados de bicarbonato de sodio se incuban a 38,5 oC y 5% deCO2 en aire, humedad máxima. Los medios con amortiguación HEPES se mantienen a 38,5 oC en horno termostátic...

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	<li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Oocytes+in+Vitro.">Maturation of Oocytes in Vitro.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).</li><li>Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+communications+regulate+chromatin+remodeling+during+bovine+oocyte+growth+and+differentiation+through+cAMP-dependent+mechanism(s).">Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s).</a> Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).</li><li>McLaughlin, M., Telfer, E. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+in+vitro+maturation+of+oocytes:+a+matter+of+follicular+differentiation.">Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation.</a> Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).</li><li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-produced+bovine+embryos:+dealing+with+the+warts.">In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts.</a> Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).</li><li>Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+reserve+of+primordial+follicles+and+the+dynamic+reserve+of+antral+growing+follicles:+what+is+the+link.">The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link.</a> Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).</li><li>Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+of+follicles+in+the+ovary+of+the+cow.">Growth rates of follicles in the ovary of the cow.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).</li><li>Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+ultrastructure+in+bovine+primordial+to+early+tertiary+follicles.">Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles.</a> Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).</li><li>Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+developmental+competence+of+bovine+oocytes+derived+from+different+categories+of+antral+follicles.">Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles.</a> Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).</li><li>Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+and+follicular+morphology+as+determining+characteristics+for+developmental+competence+in+bovine+oocytes.">Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).</li><li>Harada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+from+early+antral+follicles+grow+to+meiotic+competence+in+vitro:+effect+of+FSH+and+hypoxanthine.">Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine.</a> Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).</li><li>Hirao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+and+development+of+bovine+oocyte-granulosa+cell+complexes+on+the+flat+substratum:+effects+of+high+polyvinylpyrrolidone+concentration+in+culture+medium.">In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).</li><li>Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+meiotic+competence+of+bovine+oocytes+originating+from+early+antral+ovarian+follicles.">Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles.</a> Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).</li><li>Taketsuru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+in+secondary+follicles+grow+in+medium+containing+bovine+plasma+after+vitrification.">Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+supports+in+vitro+development+of+bovine+early+antral+follicles.">Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles.</a> Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+promote+bovine+oocyte+growth+and+connection+with+granulosa+cells.">Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells.</a> Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+to+live+young+from+bovine+small+oocytes+after+growth,+maturation+and+fertilization+in+vitro.">Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro.</a> Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).</li><li>Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PDE3A+sustains+meiotic+arrest+and+gap+junction+of+bovine+growing+oocytes+in+in+vitro+growth+culture.">Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture.</a> Theriogenology. 118, 110-118 (2018).</li><li>Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+chromatin+remodeling+in+germinal+vesicle+bovine+oocytes:+interplay+with+gap+junction+functionality+and+developmental+competence.">Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+morphology+and+transcriptional+silencing+in+relation+to+chromatin+remodeling+during+the+final+phases+of+bovine+oocyte+growth.">Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+cumulus+cell+gene+expression+indicate+the+benefit+of+a+pre-maturation+step+to+improve+in-vitro+bovine+embryo+production.">Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production.</a> Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+interact+with+natriuretic+peptide+C+to+delay+nuclear+maturation,+to+maintain+oocyte-cumulus+communication+and+to+improve+the+quality+of+in+vitro-produced+embryos+in+cattle.">Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle.</a> Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+control+of+oocyte+large-scale+chromatin+configuration+in+different+cattle+breeds.">Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds.</a> Theriogenology. 141, 146-152 (2020).</li><li>Franciosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+precursor+C+delays+meiotic+resumption+and+sustains+gap+junction-mediated+communication+in+bovine+cumulus-enclosed+oocytes.">Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes.</a> Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+levels+of+intracellular+cAMP+on+the+in+vitro+maturation+of+cattle+oocytes+and+their+subsequent+development+following+in+vitro+fertilization.">Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization.</a> Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).</li><li>Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oocyte+quality+on+development+and+transcriptional+activity+in+early+bovine+embryos.">Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos.</a> Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cilostamide+on+gap+junction+communication+dynamics,+chromatin+remodeling,+and+competence+acquisition+in+pig+oocytes+following+parthenogenetic+activation+and+nuclear+transfer.">The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer.</a> Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).</li><li>Shu, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+supports+transcription+and+improves+meiotic+competence+of+growing+bovine+oocytes.">Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes.</a> Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).</li><li>Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrophin+and+steroid+concentrations+in+bovine+follicular+fluid+and+their+relationship+to+follicle+size.">Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).</li><li>Kruip, T. A., Dieleman, S. 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A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+actions+and+the+ovary.">Androgen actions and the ovary.</a> Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).</li><li>Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+inhibits+large+granulosa+cell+apoptosis+by+stimulating+progesterone+synthesis+and+regulating+the+distribution+of+intracellular+free+calcium.">Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium.</a> Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).</li><li>Gordon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).</li><li>Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+serum-free+culture+system+supports+development+of+human+oocytes+from+primordial+follicles+in+the+presence+of+activin.">A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin.</a> Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocyte+diameter+in+relation+to+maturational+competence+and+transcriptional+activity.">Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).</li></ol>

Aquí describimos un sistema de cultivo para el cultivo de ovocitos que promueve el desarrollo de ovocitos durante 5 días apoyando su viabilidad y previniendo la reanudación meótica. Este último aspecto es de suma importancia para permitir el crecimiento y la diferenciación continuos necesarios para conferir el ócito con competencia de desarrollo meótica y embrionaria2,20, que de otro modo quedaría bloqueada por una reanudación prematura de la división ...

Durante la vida reproductiva, sólo una fracción mínima de los ovocitos que están presentes en un ovario maduro, se liberan en las trompas de Falopio tras la ovulación, y están disponibles para ser fertilizados y se convierten en un embrión viable1. Por otro lado, la mayoría de los ovocitos dentro de un ovario se someten a atresia y nunca se ovulan. Las tecnologías de producción in vitro de embriones (IVP) han intentado aumentar la explotación de la reserva ovárica2,3. Hasta ahora, estas tecnologías han permitido intervenciones de preservación de la fertilidad, programas de selección en el ganado y conservación de especies en peligro de extinción. Sin embargo, la mayoría de los protocolos utilizan ovocitos que básicamente han completado la fase de crecimiento dentro del folículo ovárico antral, y por lo tanto se conocen como ovocitos completamente crecidos. En el ganado bovino, donde las tecnologías IVP son ampliamente utilizadas, los ovocitos completamente crecidos alcanzan un diámetro final de aproximadamente 120 m y se recogen de folículos que abarcan de 2 a 8 mm de diámetro (folículos antrales medios)1. Tras el aislamiento de los folículos, estos ovocitos son in vitro madurados y fertilizados. Los cigotos se cultivan hasta la etapa del blastocisto y se transfieren a un receptor o crioconservados. En el ganado bovino, así como en muchas otras especies, a pesar del potencial que ofrecen IVP, el número de embriones producidos in vitro por vaca no mejoró en gran medida durante los últimos 40 años. Esto se debe en parte al número limitado de ovocitos completamente crecidos que pueblan un ovario en un momento dado que se puede recuperar y someter a las técnicas estándar de IVP4,5,6.
Los ovocitos encerrados dentro de los folículos antrales tempranos, es decir, aquellos folículos de menos de 2 mm de diámetro, representan una fuente potencial que se utilizará en los programas de conservación de la fertilidad7, ya que un ovario contiene aproximadamente 10 veces más folículos antrales tempranos que los folículos antrales medios8. Sin embargo, estos ovocitos todavía están en fase de crecimiento y aún no han alcanzado la etapa9completamente cultivada. Como tal, todavía están transcripcionalmente activos, produciendo mRNAs que se almacenarán para pasos posteriores del desarrollo, y todavía no han sido sometidos a todo el proceso de diferenciación necesario para conferir a los ovocitos con la capacidad de reanudar y completar espontáneamente la meiosis que una vez aislado del compartimento folicular10,,11. Por lo tanto, no pueden someterse directamente a los protocolos estándar de maduración in vitro (IVM), pero requieren un período adicional de cultivo que les permita completar la fase de crecimiento y diferenciarse adecuadamente.
La transición de la etapa de crecimiento a la etapa completamente cultivada, que en el ganado se produce cuando el folículo se desarrolla desde la etapa antral temprana a la etapa antral media, es uno de los pasos críticos durante el desarrollo de ovocitos. En bovinos, varios estudios intentaron recapitular estos eventos in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Sin embargo, hasta la fecha no se han desarrollado protocolos fiables y sólo se ha informado de un éxito limitado. Según estudios anteriores20, estos ovocitos en crecimiento constituyen una población homogénea. Además de ser transcripcionalmente activa, su cromatina se dispersa en la vesícula germinal (GV), en una configuración que se llama GV02,21. Por el contrario, la población de ovocitos totalmente crecidos obtenida a partir de folículos antrales medios es más heterogénea, una condición que se refleja en los diversos grados de compactación de la cromatina (GV1, GV2 y GV3) que se pueden observar20. Entre ellos, datos anteriores han demostrado que los ovocitos GV2 y GV3 se caracterizan en general por una mejor calidad y una mayor competencia embrionaria de desarrollo20,,21,,22,,23,,24.
Partiendo de las observaciones anteriores, aquí describimos un sistema de cultivo de 5 días de largo de ovocitos (L-IVCO) que permite la diferenciación de los ovocitos aislados como complejos cúmulos-ovocitos (COC) de los folículos antrales tempranos. Esta estrategia de cultivo ha evolucionado a partir de 10 años de estudios realizados en nuestro laboratorio y sus raíces su terreno sobre el cultivo de ovocitos in vitro (IVCO)2,sistemas de23,,25 y la suplementación de zinc durante el cultivo de ovocitos. Se utilizó una combinación de hormona estimulante del folículo (FSH) y un inhibidor de la fosfodiesterasa-3 (PDE3), capaz de mejorar la comunicación cúmulo- ovocitos2,prevenir la reanudación meótica prematura2y apoyar el crecimiento de ovocitos2.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:215px;">4-well dishes</td>
			<td style="width:127px;">Nunclon</td>
			<td style="width:123px;">179830</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:215px;">96-well dish</td>
			<td style="width:127px;">Becton Dickinson Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">356649</td>
			<td>BioCoat&#8482; Collagen I</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell culture water</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cilostamide</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>C7971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cysteamine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td>Camera DS-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glutamax Supplement</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gonal F</td>
			<td style="width:127px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Heparin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hepes</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Vacuum pump</td>
			<td>Cook-IVF</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Sanyo</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M3769</td>
			<td style="width:171px;">Powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2520</td>
			<td>Powder for M199-D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Corp</td>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td style="width:123px;">Eclipse E 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicilin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>360k molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Progesterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium choride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Testosterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">H1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle

La reserva limitada de ovocitos maduros y fertilizables representa una barrera importante para el éxito de la reproducción asistida en mamíferos. Teniendo en cuenta que durante la vida reproductiva sólo alrededor del 1% de los ovocitos en un ovario maduro y ovulado, se han desarrollado varias técnicas para aumentar la explotación de la reserva ovárica a la creciente población de folículos no ovulatorios. Estas tecnologías han permitido intervenciones de preservación de la fertilidad, programas de selección en ganado y conservación de especies en peligro de extinción. Sin embargo, el enorme potencial de la reserva ovárica sigue siendo en gran medida sin explotar. En las vacas, por ejemplo, se han hecho algunos intentos de apoyar la cultura in vitro de ovocitos en etapas específicas del desarrollo, pero aún no se han desarrollado protocolos eficientes y fiables. Aquí describimos un sistema de cultivo que reproduce las condiciones fisiológicas de la etapa folicular correspondiente, definida para desarrollar ovocitos de crecimiento in vitro recogidos de los folículos antrales tempranos bovinos a la etapa completamente adulta, correspondiente al folículo antral medio in vivo. Se utilizó una combinación de hormonas y un inhibidor de la fosfodiesterasa 3 para prevenir la reanudación meótica prematuramente y para guiar la diferenciación de los ovocitos.

Al final de la L-IVCO, la morfología bruta de los COC cambió y 4 clases se identificaron en función de la aparición de las células cúmulos, como se muestra en la Figura 2. Sobre la base de los criterios morfológicos comúnmente adoptados para seleccionar COCs sanos11,26,27, las clases 1, 2 y 3 fueron juzgados sanos, mientras que la clase 4, que mostraba signos claros de degeneración como la ...

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In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Describimos los procedimientos para el aislamiento de ovocitos en crecimiento de los folículos ováricos en las primeras etapas de desarrollo, así como la instalación de un sistema de cultivo in vitro que puede apoyar el crecimiento y la diferenciación hasta la etapa completamente adulta.

Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

En este protocolo de vídeo, demostramos en detalle un sistema de cultivo para el cultivo de ovocitos bovinos. El sistema soporta la viabilidad de los ovocitos en la cultura durante un máximo de cinco días y permite su diferenciación. Usando este sistema de cultivo, los ovocitos recogidos de pequeños folículos antrales, que normalmente no se utilizan en protocolos estándar para in vitro en la producción, pueden ser cultivados para aumentar la disponibilidad de gametos fertilizables.Esta explotación de la reserva más amplia, puede proporcionar nuevas opciones para el salvamento genético de especies amenazadas, de la familia bovina, o de razas locales en riesgo de erosión genética. Para empezar, preparar 15 mililitros de medio de cultivo básico y complementarlo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. A continuación, preparar tres mililitros de medio de retención añadiendo cinco cilostamida micromolar al medio de cultivo básico y verter en un plato Petri de 35 milímetros.Preparar el medio IVCO largo complementando el medio de cultivo básico de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Agregue 200 microlitros de medio IVCO largo a cada pozo de una placa recubierta de 96 bien. A continuación, llene los cuatro bordes con agua estéril para compensar la evaporación y mantener la humedad adecuada durante el cultivo.Incubar la placa de 96 pozos y el medio de retención a 38,5 grados centígrados y 5% dióxido de carbono con la humedad máxima. Lavar los ovarios cuatro veces en solución salina estéril, mantenida a 26 grados centígrados. A continuación, aspirar todos los folículos de más de dos milímetros de diámetro, con una aguja de calibre 18 conectada a una bomba de aspiración.Encaje los ovarios aspirados en un vaso de precipitados con solución salina estéril mantenida a 26 grados centígrados. Coloque un ovario a la vez en una tabla de cortar PTFE estéril, y utilice una cuchilla quirúrgica número 22 para cortar rodajas de corteza ovárica que tienen 1,5 a dos milímetros de espesor, y paralelas al eje principal del órgano. Encaje las rodajas de corteza ovárica en un plato de cristal estéril Petri, con medio diseccionante en un plato caliente, a 38,5 grados centígrados.Encaje una rodaja de corteza ovárica en una placa Petri de vidrio de 60 milímetros, con dos o tres mililitros de M199D bajo un microscopio de disección, seleccione los folículos que están entre 5 y dos milímetros. Identificar los folículos no atrérticos sanos bajo el microscopio estéreo, mediante la observación de parámetros morfológicos, como una apariencia translúcida uniformemente brillante, una vascularización extensa y una capa regular de granulosa. Mientras que los folículos atériticos tienen un aspecto opaco gris, y están mal vascularizados, con un COC oscuro en el interior.Deseche los folículos atériticos y procese todos los demás. Utilice la cuchilla quirúrgica para extraer el tejido ovárico que rodea el folículo en un lado, hasta que se exponga. Luego use una aguja de calibre 26 para hacer cuidadosamente una hendidura en la pared del folículo expuesta, que liberará el contenido folicular que comprende el COC, el líquido folicular y los grupos de células.Identificar el COC y examinarlo en busca de integridad cúmulo, integridad de la zona pellucida y homogeneidad del citoplasma. Si se cumplen estos criterios, aspire el COC con una pipeta P20. Encaje el COC aislado en cilostamida M199D y continúe el procedimiento de aislamiento durante 30 minutos.Después de seleccionar los COC, como se describió anteriormente, prepare 16 gotas con 20 microlitros de cilostamida M199D en una placa Petri de 60 milímetros, y coloque un COC saludable en cada gota. Utilice un microscopio invertido conectado a una cámara para medir el diámetro de los ovocitos, excluyendo la zona pellucida. Con una visualización clara del cito, realice dos mediciones perpendiculares, asegúrese de que la media de las dos mediciones está dentro de un rango de 100 a 110 micrómetros.Puede ser difícil medir con precisión el diámetro de los ovocitos, debido a las células cúmulos compañeras. Los COC que tienen ovocitos con un diámetro más pequeño o más grande, o que no tienen un ovocitos redondeado, o aquellos con ovocitos que no son medibles, deben descartarse. Transfiera los COC seleccionados a un plato de 35 milímetros que contenga medio M199H, y manténgalos en la incubadora a 38,5 grados centígrados y 5% dióxido de carbono con la humedad máxima, asegúrese de que el tiempo de trabajo general no exceda de dos horas.Una vez completados los procedimientos de selección y recogida, transfiera un COC al centro de cada pozo de la placa de 96 pozos previamente preparada. Incubar la placa durante cinco días a 38,5 grados centígrados y 5% dióxido de carbono con la humedad máxima, refrescar el medio cada dos días. Para renovar el medio, sustituya 100 microlitros de medio antiguo por 100 microlitros de medio IVCO largo fresco, haga esto bajo el microscopio estéreo para evitar mover los COC.Al final del IVCO largo, analizar la morfología de los COC. Si tienen una inversión de células cúmulos compactas sin signos de expansión cúmulo, o degeneración celular, clasifique como clase uno. Si los COC tienen una inversión celularcumulus compacta sin signos de expansión cúmulo o degeneración celular, y con una o más formaciones similares a los atramos, clasifiquelas como clase dos.Clase tres COC, muestran varias capas de células cúmulos sin signo de expansión cúmulo, algunas células desagregadas en la capa externa de las células cúmulos y ninguna formación similar a un antrum. Clasificar los COC como clase cuatro si muestran una pérdida abundante de células cúmulos que se extienden por más del 50% de la superficie de ovocitos, así como signos de degeneración celular y desechos celulares. Al final del IVCO largo se cambia la morfología bruta del COC.Y cuatro clases fueron identificadas en base a la aparición de las células cúmulos. En total, se analizaron 74 ovocitos en cinco réplicas biológicas, de las cuales el 9,45% fueron descartadas de una evaluación posterior. Las clases uno, dos y tres fueron juzgadas sanas, mientras que la clase cuatro mostró signos claros de degeneración, como la ausencia de capas completas de células cúmulos que rodeaban a los ovocitos.Estos COC se consideraron inadecuados para someterse a procedimientos posteriores en un entorno de IVP prospectivo. La evaluación de la etapa meítica al final del largo IVCO mostró que un porcentaje significativamente mayor de los ovocitos seguía detenidos en la etapa inmadura, con la cromatina todavía incluida en el GV. Cuando se investigó la condensación de cromatina dentro del GV como un marcador de ganancia de competencia, la transición de la configuración de cromatina a etapas más condensadas, a saber, GV dos y GV tres, se observó en el 59% de los ovocitos. Un pequeño porcentaje reanudó la meiosis alcanzando la metafase una etapa, o degeneración.Estos resultados demuestran que la cultura L-IVCO apoya la viabilidad de los ovocitos, evitando al mismo tiempo la reanudación meótica durante cinco días. Al final del IVCO largo, los COC pueden utilizarse en procedimientos posteriores de la producción in vitro de embriones, a saber, la maduración in vitro, la fertilización y el cultivo embrionario. Estos pasos son necesarios para proporcionar prueba de concepto de que el ovocitos ha adquirido una mayor competencia de desarrollo.Además de mantener el potencial de aumentar la cantidad de ovocitos fertilizables, el largo sistema de cultivo IVCO es una herramienta para los científicos que están interesados en diseccionar los procesos celulares y moleculares que regulan la formación de un gameto competente.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Investigación

Biología del Desarrollo

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Cultivo In Vitro de Células Epiteliales de Diferentes Regiones Anatómicas de la Membrana Amniótica Humana

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...