Name: in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle
Uploaded: 2020-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 och UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Äggstockar samlades in från 4 till 8 år gamla Holstein mjölkkor som återvunnits på det lokala slakteriet (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italien).
1. Förberedelse av media
OBS: Alla medier måste förberedas minst fyra timmar före användning. Natriumbikarbonatbuffrade medier inkuberas vid 38,5 °C och 5 % CO2 i luft, maximal fuktighet. HEPES-buffrade medier underhålls vid 38,5 °C i termostatugn.
<ol><li>Lång in vitro-...

<ol>
	<li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Oocytes+in+Vitro.">Maturation of Oocytes in Vitro.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).</li><li>Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+communications+regulate+chromatin+remodeling+during+bovine+oocyte+growth+and+differentiation+through+cAMP-dependent+mechanism(s).">Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s).</a> Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).</li><li>McLaughlin, M., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+bovine+primordial+follicles+is+promoted+by+activin+and+FSH+within+a+two-step+serum-free+culture+system.">Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system.</a> Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).</li><li>Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achievements+and+unmet+promises+of+assisted+reproduction+technologies+in+large+animals:+a+per-sonal+perspective.">Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective.</a> Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).</li><li>Luciano, A. M., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+in+vitro+maturation+of+oocytes:+a+matter+of+follicular+differentiation.">Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation.</a> Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).</li><li>Lonergan, P., Fair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-produced+bovine+embryos:+dealing+with+the+warts.">In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts.</a> Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).</li><li>Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+reserve+of+primordial+follicles+and+the+dynamic+reserve+of+antral+growing+follicles:+what+is+the+link.">The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link.</a> Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).</li><li>Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+of+follicles+in+the+ovary+of+the+cow.">Growth rates of follicles in the ovary of the cow.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).</li><li>Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+ultrastructure+in+bovine+primordial+to+early+tertiary+follicles.">Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles.</a> Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).</li><li>Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+developmental+competence+of+bovine+oocytes+derived+from+different+categories+of+antral+follicles.">Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles.</a> Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).</li><li>Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+and+follicular+morphology+as+determining+characteristics+for+developmental+competence+in+bovine+oocytes.">Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).</li><li>Harada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+from+early+antral+follicles+grow+to+meiotic+competence+in+vitro:+effect+of+FSH+and+hypoxanthine.">Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine.</a> Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).</li><li>Hirao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+and+development+of+bovine+oocyte-granulosa+cell+complexes+on+the+flat+substratum:+effects+of+high+polyvinylpyrrolidone+concentration+in+culture+medium.">In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).</li><li>Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+meiotic+competence+of+bovine+oocytes+originating+from+early+antral+ovarian+follicles.">Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles.</a> Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).</li><li>Taketsuru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocytes+in+secondary+follicles+grow+in+medium+containing+bovine+plasma+after+vitrification.">Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+supports+in+vitro+development+of+bovine+early+antral+follicles.">Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles.</a> Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+promote+bovine+oocyte+growth+and+connection+with+granulosa+cells.">Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells.</a> Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+to+live+young+from+bovine+small+oocytes+after+growth,+maturation+and+fertilization+in+vitro.">Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro.</a> Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).</li><li>Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PDE3A+sustains+meiotic+arrest+and+gap+junction+of+bovine+growing+oocytes+in+in+vitro+growth+culture.">Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture.</a> Theriogenology. 118, 110-118 (2018).</li><li>Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+chromatin+remodeling+in+germinal+vesicle+bovine+oocytes:+interplay+with+gap+junction+functionality+and+developmental+competence.">Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+morphology+and+transcriptional+silencing+in+relation+to+chromatin+remodeling+during+the+final+phases+of+bovine+oocyte+growth.">Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+cumulus+cell+gene+expression+indicate+the+benefit+of+a+pre-maturation+step+to+improve+in-vitro+bovine+embryo+production.">Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production.</a> Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormones+interact+with+natriuretic+peptide+C+to+delay+nuclear+maturation,+to+maintain+oocyte-cumulus+communication+and+to+improve+the+quality+of+in+vitro-produced+embryos+in+cattle.">Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle.</a> Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).</li><li>Soares, A. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+control+of+oocyte+large-scale+chromatin+configuration+in+different+cattle+breeds.">Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds.</a> Theriogenology. 141, 146-152 (2020).</li><li>Franciosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptide+precursor+C+delays+meiotic+resumption+and+sustains+gap+junction-mediated+communication+in+bovine+cumulus-enclosed+oocytes.">Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes.</a> Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+levels+of+intracellular+cAMP+on+the+in+vitro+maturation+of+cattle+oocytes+and+their+subsequent+development+following+in+vitro+fertilization.">Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization.</a> Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).</li><li>Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oocyte+quality+on+development+and+transcriptional+activity+in+early+bovine+embryos.">Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos.</a> Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).</li><li>Dieci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cilostamide+on+gap+junction+communication+dynamics,+chromatin+remodeling,+and+competence+acquisition+in+pig+oocytes+following+parthenogenetic+activation+and+nuclear+transfer.">The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer.</a> Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).</li><li>Shu, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Lodde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+supports+transcription+and+improves+meiotic+competence+of+growing+bovine+oocytes.">Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes.</a> Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).</li><li>Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrophin+and+steroid+concentrations+in+bovine+follicular+fluid+and+their+relationship+to+follicle+size.">Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).</li><li>Kruip, T. A., Dieleman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+concentrations+in+the+fluid+of+bovine+follicles+relative+to+size,+quality+and+stage+of+the+oestrus+cycle.">Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle.</a> Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).</li><li>Sakaguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+antral+follicle+count,+steroidogenesis,+and+secretion+of+follicle-stimulating+hormone+and+anti-Mullerian+hormone+during+follicular+growth+in+cattle.">Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).</li><li>Makita, M., Miyano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+promote+the+acquisition+of+maturation+competence+in+bovine+oocytes.">Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes.</a> Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).</li><li>Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+actions+and+the+ovary.">Androgen actions and the ovary.</a> Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).</li><li>Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+inhibits+large+granulosa+cell+apoptosis+by+stimulating+progesterone+synthesis+and+regulating+the+distribution+of+intracellular+free+calcium.">Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium.</a> Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).</li><li>Gordon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).</li><li>Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+serum-free+culture+system+supports+development+of+human+oocytes+from+primordial+follicles+in+the+presence+of+activin.">A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin.</a> Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+oocyte+diameter+in+relation+to+maturational+competence+and+transcriptional+activity.">Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).</li></ol>

Här beskriver vi ett kultursystem för växande oocyter som främjar oocyte utveckling i 5 dagar genom att stödja deras livskraft och förhindra meiotiska återupptagande. Denna senare aspekt är av yttersta vikt att tillåta fortsatt tillväxt och differentiering som är nödvändig för att förläna oocyten med meiotisk och embryonal utvecklingskompetens2,20, som annars skulle blockeras av ett förtidigt återupptagande av meiotiska divisionen.
<p class=...

Under den reproduktiva livslängden, endast en minimal fraktion av de äggceller som är närvarande i en äggstock mogna, frigörs i äggledarna vid ägglossningen, och är tillgängliga för att befruktas och utvecklas till en livskraftig embryo1. Å andra sidan, de flesta av äggceller inom en äggstock genomgår atresia och är aldrig ägglossning. In vitro embryo produktion (IVP) teknik har försökt att öka utnyttjandet av äggstocksreserven2,3. Hittills har sådan teknik tillåtit insatser av fertilitet bevarande, urvalsprogram i boskap, och bevarande av utrotningshotade arter. Ändå, de flesta protokoll använder oocyter som i princip har avslutat tillväxtfasen inom antral ovariefolicle, och därmed kallas fullvuxna äggceller. Hos nötkreatur, där IVP-teknik används i stor utsträckning, når fullvuxna äggceller en slutlig diameter på cirka 120 μm och samlas in från folliklar som sträcker sig från 2 till 8 mm i diameter (medelstora antrala folliklar)1. Vid isolering från folliklaren, är sådana äggceller in vitro mognat och befruktas. Zygoterna odlas sedan upp till blastocyststadiet och antingen överförs till en mottagare eller cryopreserved. Hos nötkreatur, liksom i många andra arter, trots den potential som ivp erbjuder, förbättrades inte i hög grad antalet in vitro-producerade embryon per ko under de senaste 40 åren. Detta beror delvis på det begränsade antalet fullvuxna äggceller som fyller en äggstock vid en viss tidpunkt som kan hämtas och utsättas för standard IVP-tekniker4,5,6.
De oocyter inneslutna inom tidiga antral folliklar, dvs de folliklar som är mindre än 2 mm i diameter, utgör en potentiell källa som ska användas i fertilitet bevarande program7 , som en äggstock ungefär innehåller 10 gånger mer tidiga antral folliklar än medium en8. Dessa oocyter befinner sig dock fortfarande i tillväxtfasen och har ännu inte nått det fullvuxna stadiet9. Som sådan, de är fortfarande transkriptionellt aktiva, producerar mRNAs som kommer att lagras för senare utvecklingsmässiga steg, och har ännu inte genomgått alla de differentieringsprocess som krävs för att förläna oocyterna med förmåga att spontant återuppta och slutföra meios jag en gång isolerade från follikulära fack10,11. Därför kan de inte direkt överlämnas till standardprotokoll för in vitro-mognad (IVM), men de kräver ytterligare en period av kultur som skulle göra det möjligt för dem att slutföra tillväxtfasen och korrekt differentiera.
Övergången från det växande till det fullvuxna stadiet, som hos nötkreatur sker när follikeln utvecklas från den tidiga antral till det medelstora antralstadiet, är ett av de kritiska stegen under oocyteutvecklingen. Hos nötkreatur, flera studier försökt att rekapitulera dessa händelser in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Hittills har dock inga tillförlitliga protokoll utvecklats och endast begränsad framgång har rapporterats. Enligt tidigare studier20, dessa växande oocyter utgör en homogen population. Förutom att vara transkriptionellt aktiv, är deras kromatin spridda i germinal vesikel (GV), i en konfiguration som heter GV02,21. Omvänt är befolkningen i fullvuxna oocyter som erhålls från medelstora antrala folliklar mer heterogena, ett tillstånd som speglas av de olika grader av kromatin kompaktering (GV1, GV2 och GV3) som kan observeras20. Bland dessa har tidigare uppgifter visat att GV2 och GV3 oocyter är övergripande kännetecknas av en bättre kvalitet och högre embryonal utvecklingskompetens20,21,22,23,24.
Med utgångspunkt från ovanstående iakttagelser, här beskriver vi en 5-dagars lång kultur system av äggceller (L-IVCO) som gör det möjligt att differentiera oocytes isoleras som cumulus-oocyte komplex (COCs) från tidiga antrala folliklar. Denna kultur strategi har utvecklats från 10 år långa studier som genomförts i vårt labb och rötter sin grund på de tidigare utvecklade 24-48 timmar in vitro-oocyte kultur (IVCO)2, prematuration system23,25 och zink tillskott under äggcell kultur . En kombination av follikelstimulerande hormon (FSH) och en phosphodiesterase-3 (PDE3) hämmare, kunna förstärka cumulus-oocyte kommunikation2, förhindra untimely meiotisk återupptagande2, och stöd oocyte tillväxt2 användes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:215px;">4-well dishes</td>
			<td style="width:127px;">Nunclon</td>
			<td style="width:123px;">179830</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:215px;">96-well dish</td>
			<td style="width:127px;">Becton Dickinson Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">356649</td>
			<td>BioCoat&#8482; Collagen I</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell culture water</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cilostamide</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>C7971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cysteamine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td>Camera DS-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glutamax Supplement</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gonal F</td>
			<td style="width:127px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Heparin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hepes</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Vacuum pump</td>
			<td>Cook-IVF</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Sanyo</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M3769</td>
			<td style="width:171px;">Powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:215px;">Medium 199</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2520</td>
			<td>Powder for M199-D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Corp</td>
			<td>Nikon Diaphot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Corp</td>
			<td style="width:123px;">Eclipse E 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicilin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>360k molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Progesterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium choride</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td>P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Testosterone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">H1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:123px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture strategy for oocytes from early antral follicle in cattle

Den begränsade reserven av mogna, fruktbara äggceller utgör en stor barriär för framgång assisterad reproduktion hos däggdjur. Med tanke på att under den reproduktiva livslängden endast cirka 1% av äggceller i en äggstock mogna och ägglossning, har flera tekniker utvecklats för att öka exploatering av äggstocksreserven till den växande befolkningen av icke-ägglossning folliklar. Sådan teknik har tillåtit insatser av fertilitet bevarande, urvalsprogram i boskap, och bevarande av utrotningshotade arter. Men den stora potentialen i äggstocksreserven är fortfarande i stort sett outnyttjad. Hos kor har till exempel vissa försök gjorts att stödja in vitro-kulturen av oocyter i specifika utvecklingsstadier, men effektiva och tillförlitliga protokoll har ännu inte utvecklats. Här beskriver vi ett kultursystem som återger de fysiologiska villkoren för motsvarande follikulära skede, definieras för att utveckla in vitro växande oocyter som samlats in från nötkreatur tidiga antrala folliklar till fullvuxen skede, motsvarande den medelstora antral follicle in vivo. En kombination av hormoner och en phosphodiesterase 3-hämmare användes för att förhindra untimely meiotic återupptagande och att vägleda äggcells differentiering.

I slutet av L-IVCO ändrades KOL:nas bruttomorfologi och 4 klasser identifierades utifrån cumuluscellernas utseende, vilket visas i figur 2. Baserat på de morfologiska kriterier som vanligen antagits för att välja friska COCs11,26,27, klass 1, 2 och 3 bedömdes friska, medan klassen 4, som visade tydliga tecken på degeneration såsom avsaknad av kompletta lager av cumulus celler som omger äggc...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle at JoVE.com

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Vi beskriver de förfaranden för isolering av växande oocytes från äggstockscancer folliklar i tidiga skeden av utvecklingen, samt inställning av en in vitro-kultur system som kan stödja tillväxt och differentiering upp till fullvuxen skede.

In Vitro kulturstrategi för Oocytes från tidig Antral Follicle i nötkreatur

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

I denna video protokoll, vi demonstrera i detalj, ett kultursystem för växande bovin oocyter. Systemet stöder oocyterna livskraft i kulturen i upp till fem dagar och möjliggör deras differentiering. Med hjälp av detta odlingssystem, kan äggceller som samlats in från små antrala folliklar, som normalt inte används i standardprotokoll för in vitro i produktionen, odlas för att öka tillgången på fertilizable gametes.Detta utnyttjande av den bredare reserven kan ge nya alternativ för genetisk bärgning av hotade arter, av nötkreatursfamiljen, eller av lokala raser som riskerar genetisk erosion. Till att börja, förbereda 15 milliliter av grundläggande odlingsmedium och komplettera den enligt manuskriptriktningar. Därefter förbereda tre milliliter av holding medium genom att lägga till fem mikromolar cilostamide till det grundläggande odlingsmediet och häll det i en 35 millimeter Petriskål.Förbered långt IVCO-medium genom att komplettera grundläggande odlingsmedium enligt manuskriptriktningar. Tillsätt 200 mikroliter av långt IVCO-medium till varje brunn av en 96-brunnsbelagd platta. Fyll sedan de fyra kanterna med sterilt vatten för att kompensera för avdunstning och för att bibehålla lämplig fuktighet under kulturen.Inkubera 96-brunnsplattan och holdingmediet vid 38,5 grader celsius och 5%koldioxid med maximal fuktighet. Tvätta äggstockarna fyra gånger i steril saltlösning, bibehålls vid 26 grader celsius. Därefter aspirera alla folliklar som är mer än två millimeter i diameter, med en 18 gauge nål ansluten till en aspirationspump.Snöra de aspirerade äggstockarna i en bägare med steril saltlösning som bibehålls vid 26 grader celsius. Placera en äggstock i taget på en steril PTFE skärbräda, och använda ett kirurgiskt nummer 22 blad för att skära skivor av äggstocks cortex som är 1,5 till två millimeter tjock, och parallellt med den stora axeln av orgeln. Snöra skivorna av äggstocks cortex i en steril glas Petriskål, med dissekera medium på en varm tallrik, på 38,5 grader celsius.Spets en äggstocks cortex skiva i en 60 millimeters glas Petriskål, med två till tre milliliter M199D under en dissekering mikroskop, välj folliklar som är mellan 5 och två millimeter. Identifiera de friska icke-atreetiska folliklarna under stereomikroskopet, genom att observera morfologiska parametrar, såsom ett enhetligt ljust genomskinligt utseende, omfattande kärlbildning och ett vanligt granulosaskikt. Medan atretic folliklar har en grå ogenomskinlig utseende, och är dåligt vascularized, med en mörk COC inuti.Kassera de atreetiska folliklarna och bearbeta alla de andra. Använd operationsbladet för att avlägsna den äggstocksvävnad som omger follikeln på ena sidan, tills den exponeras. Använd sedan en 26 gauge nål för att noggrant göra en slits i den exponerade follikelväggen, som kommer att släppa follikulärinnehållet bestående av COC, follikulär vätska och klumpar av celler.Identifiera COC och undersöka det för cumulus integritet, zona pellucida integritet och homogenitet av cytoplasman. Om dessa kriterier är uppfyllda, aspirera COC med en P20-pipett. Lace den isolerade COC i M199D cilostamid, och fortsätta isoleringsproceduren i 30 minuter.Efter att ha valt COCs, som tidigare beskrivits, förbereda 16 droppar med 20 mikroliter av M199D cilostamide i en 60 millimeter Petriskål, och placera en hälsosam COC i varje droppe. Använd ett inverterat mikroskop som är fäst vid en kamera för att mäta oocytediametern, exklusive zona pellucida. Med en tydlig visualisering av oocyte, gör två vinkelräta mätningar, försäkra att medelvärdet av de två mätningarna är inom ett intervall av 100 till 110 mikrometer.Det kan vara svårt att exakt mäta oocyterna diameter, på grund av följeslagare cumulus celler. COCs som har äggceller med mindre eller större diameter, eller som inte har en rundad äggcell, eller de med äggceller som inte är mätbara, bör kasseras. Överför de utvalda COCs i en 35 millimeters maträtt som innehåller M199H medium, och hålla dem i inkubatorn på 38,5 grader celsius och 5%koldioxid med maximal fuktighet, se till att den totala arbetstiden inte överstiger två timmar.När urvals- och insamlingsförfarandena är avslutade, överför en COC i mitten av varje brunn av den tidigare beredda 96-brunnsplattan. Inkubera plattan i fem dagar vid 38,5 grader celsius och 5%koldioxid med maximal fuktighet, uppdatera mediet varannan dag. För att förnya mediet, ersätta 100 mikroliter av gammalt medium med 100 mikroliter av färskt långt IVCO medium, gör detta under stereomikroskopet för att undvika att flytta COCs.I slutet av den långa IVCO, analysera COCs morfologi. Om de har en kompakt cumulus cell investering utan tecken på cumulus expansion, eller cell degeneration, klassificera dem som klass ett. Om COCs har en kompakt cumulus cell investering utan tecken på cumulus expansion eller cell degeneration, och med en eller flera antrum-liknande formationer, klassificera dem som klass två.Klass tre COCs, visa flera lager av cumulus celler utan tecken på cumulus expansion, några disaggregerade celler i det yttre lagret av cumulus cellerna och ingen antrum-liknande bildning. Klassificera COCs som klass fyra om de visar riklig förlust av cumulus celler sträcker sig för mer än 50%av äggcellsytan, samt tecken på celldegeneration och cellskräp. På avsluta av långa IVCO ändras den brutto- morfologin av COCEN.Och fyra klasser identifierades baserat på utseendet på cumuluscellerna. Totalt 74 oocytes i fem biologiska replikat analyserades, varav, 9,45%kasserades från ytterligare utvärdering. Klasserna ett, två och tre bedömdes friska, medan klass fyra visade tydliga tecken på degeneration, såsom avsaknad av kompletta lager av cumulus celler som omger oocyterna.Dessa COCs ansågs olämpliga att genomgå förfaranden nedströms i en blivande IVP-inställning. Bedömning av meiotiska stadiet i slutet av den långa IVCO visade att en betydligt högre andel av oocyterna förblev arresterad på det omogna stadiet, med kromatin fortfarande inneslutna inom GV. När kromatin kondensation inom GV undersöktes som en markör för vinst av kompetens, övergången av kromatin konfigurationen till mer kondenserade stadier, nämligen GV två och GV tre, observerades i 59%av oocyterna. En liten andel återupptogs meios nå metafas ett steg, eller degeneration.Dessa resultat visar att L-IVCO kultur stöder oocyte livskraft, samtidigt förhindra meiotiska återupptagande i fem dagar. I slutet av den långa IVCO, COCs kan användas i nedströms förfaranden för in vitro embryoproduktion, nämligen in vitro-mognad, befruktning, och embryo kultur. Dessa steg är nödvändiga för att ge bevis på konceptet att oocyten har förvärvat en högre utvecklingskompetens.Förutom att hålla potentialen att öka mängden fertila äggceller, den långa IVCO kultursystemet är ett verktyg för forskare som är intresserade av att dissekera cellulära och molekylära processer som reglerar bildandet av en kompetent gamete.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Förstå Tidig Organogenesis användning av en förenklad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering protokollet<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic tillvägagångssätt för att bedöma Bildande av neurala anslutningar i en samodlingssystemet

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcellsliknande<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonala Explantat att studera tidig Neural Utvecklings funktioner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolering och karakterisering av mus Antral oocyter Baserat på Nukleolärt Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av cellulära elektrisk aktivitet i zebrafiskar tidiga embryon och tumörer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In vitro-kultur av epitelceller från olika anatomiska regioner i det mänskliga fosterhinnan

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...