Name: calcium imaging in freely behaving caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration at JoVE.com

نشكر مركز Caenorhabditis Genetics Center على توفير السلالات المستخدمة في هذه الدراسة. تم دعم هذا المنشور من قبل JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant No. JP18H02483)، بشأن مشروع "علم الروبوت الناعم" في المجالات المبتكرة (رقم المنحة. JP18H05474)، وPRIME من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (رقم المنحة 19gm6110022h001)، ومؤسسة شيمادزو.

1. زراعة الديدان حتى تصوير الكالسيوم
<ol><li>قبل أربعة أيام من تجربة تصوير الكالسيوم، انقل اثنين من ديدان ST12 البالغة إلى صفيحة جديدة متوسطة النمو الخيطية (NGM) (جدول المواد) حيث يتم رسم الإشريكية القولونية OP50 في نمط مربع (حوالي 4 مم × 4 مم) باستخدام موزع الخلايا بحيث تقضي الدودة معظم...

<ol>
	<li>Hill, P. S. M., Wessel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotremology.">Biotremology.</a> Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).</li><li>Fettiplace, R., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+and+motor+roles+of+auditory+hair+cells.">The sensory and motor roles of auditory hair cells.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions.">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).</li><li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeling+force:+physical+and+physiological+principles+enabling+sensory+mechanotransduction.">Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).</li><li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanotransduction.">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+circuit+for+touch+sensitivity+in+Caenorhabditis+elegans.">The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).</li><li>Wicks, S. R., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integration+of+antagonistic+reflexes+revealed+by+laser+ablation+of+identified+neurons+determines+habituation+kinetics+of+the+Caenorhabditis+elegans+tap+withdrawal+response.">The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response.</a> Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).</li><li>Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+new+model+system+for+the+study+of+learning+and+memory.">Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory.</a> Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).</li><li>Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+plasticity+in+a+Caenorhabditis+elegans+mechanosensory+circuit.">Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit.</a> Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).</li><li>Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+optical+quantification+of+mechanosensory+habituation+reveals+neurons+encoding+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+stimulation+method+for+quantifying+C.+elegans+mechanosensory+behavior+and+memory.">Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory.</a> Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).</li><li>Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressional+and+surface+waves+in+sand:+used+by+desert+scorpions+to+locate+prey.">Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey.</a> Science. 197 (4302), 479-482 (1977).</li><li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients.">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).</li><li>Tsukada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+spatial+thermal+gradient+encoded+in+thermosensory+neuron+AFD+in+Caenorhabditis+elegans.">Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).</li><li>Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+circuits+and+synaptic+mechanisms+underlying+motor+initiation+in+C.+elegans.">The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans.</a> Cell. 147 (4), 922-933 (2011).</li><li>Nguyen, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+calcium+imaging+with+cellular+resolution+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans.">Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).</li><li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Prevedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+whole-animal+3D+imaging+of+neuronal+activity+using+light-field+microscopy.">Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy.</a> Nature Methods. 11, 727-730 (2014).</li><li>Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+brain+state+underlies+C.+elegans+sleep+behavior.">A global brain state underlies C. elegans sleep behavior.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+multiple+neurons+in+freely+behaving+C.+elegans.">Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).</li><li>Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+collectively+forms+dynamical+networks.">C. elegans collectively forms dynamical networks.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li></ol>

بشكل عام ، يتطلب التحديد الكمي للنشاط العصبي إدخال مسبار و / أو قيود على حركة جسم الحيوان. ومع ذلك ، بالنسبة لدراسات السلوك الحسي الميكانيكي ، فإن الإدخال الغازي للمسبار والقيود نفسها تشكل محفزات ميكانيكية. يوفر C. elegans نظاما للتحايل على هذه المشاكل ، لأن ميزاته شفافة ولأنه يحتوي على دا...

غالبا ما تتعرض الحيوانات لمحفزات ميكانيكية غير موضعية مثل الاهتزازات أو الموجات الصوتية 1,2. نظرا لأن هذه المحفزات تؤثر على التوازن والتنمية والتكاثر ، يجب على الحيوانات تعديل سلوكياتها للتعامل معها3،4،5. ومع ذلك ، فإن الدوائر العصبية والآليات الكامنة وراء هذا التعديل السلوكي غير مفهومة بشكل جيد.
السلوك الحسي الميكانيكي في الديدان الخيطية ، Caenorhabditis elegans ، هو نموذج سلوكي بسيط ، حيث عادة ما تغير الديدان السلوك من الحركة الأمامية إلى استجابة الهروب إلى الخلف عندما تواجه اهتزازا غير موضعي6. تتكون الدائرة العصبية الكامنة وراء هذا السلوك في المقام الأول من خمس خلايا عصبية حسية ، وأربعة أزواج من الخلايا العصبية الداخلية ، وعدة أنواع من الخلايا العصبية الحركية 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تعتاد الديدان على مثل هذه المحفزات الميكانيكية بعد التدريب المتباعد الذي ينطوي على التحفيز المتكرر9،10،11. لذلك ، تشكل هذه الاستجابة السلوكية البسيطة نظاما مثاليا للتحقيق في الآليات العصبية الكامنة وراء كل من السلوك والذاكرة غير الموضعية التي يستحدثها الاهتزاز. تم توضيح بروتوكول لتصوير الكالسيوم في الديدان التي تتصرف بحرية تحت تأثير الاهتزازات غير الموضعية. بالمقارنة مع الأنظمة التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، فإن هذا النظام بسيط من حيث أنه لا يتطلب كاميرا إضافية للتتبع ؛ ومع ذلك ، فإنه يسمح لنا بتغيير تردد وإزاحة ومدة الاهتزاز غير الموضعي. نظرا لأن تنشيط الخلايا العصبية الداخلية AVA يحفز استجابة الهروب إلى الوراء ، فقد تم استخدام الديدان التي تشارك في التعبير عن GCaMP ، وهو مؤشر الكالسيوم ، و TagRFP ، وهو بروتين فلوري غير حساس للكالسيوم ، تحت سيطرة مروج خاص ب AVA كمثال (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). يوضح البروتوكول تنشيط الخلايا العصبية AVA حيث تتحول الدودة من الحركة إلى الأمام إلى الخلف. يسهل هذا البروتوكول فهم آلية الدائرة العصبية الكامنة وراء السلوك الحسي الميكانيكي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Data anaylsis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DualViewImaging.nb</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of acquired data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mathematica12</td>
			<td>Wolfram</td>
			<td></td>
			<td>For running data anaysis software DualViewImaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli and C. elegans strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lite-1(ce314) strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>KG1180</td>
			<td>Light-insensitive mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter</td>
			<td>author</td>
			<td>ST12</td>
			<td>lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler vibrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lase Doppler vibrometer</td>
			<td>Polytec Japan</td>
			<td>IVS-500</td>
			<td>For quantifying&#160; frequency and displacement generated by the accoustic transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse macro system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay.txt</td>
			<td>Author</td>
			<td></td>
			<td>Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiMacroEx</td>
			<td>Vector</td>
			<td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html</td>
			<td>Free download software for controling mouse cursor based on a script</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth media plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar purified, powder</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01162-15</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto pepton</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211677</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-00485</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>034-03002</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Photassium hydrogenphosphate</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>28727-95</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>20066-95</td>
			<td>For culture of E. coli OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous</td>
			<td>TGI</td>
			<td>M1890</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>28720-65</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>31320-05</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150270</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonlocalized vibration device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>LEPY</td>
			<td>LP-A7USB</td>
			<td>For stimulation with controllable vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic transducer</td>
			<td>MinebeaMitsumi</td>
			<td>LVC25</td>
			<td>For stimulation with controllable vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaveGene Ver. 1.5</td>
			<td>Thrive</td>
			<td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td>
			<td>Free download software for controling vibration property</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noninvasive calcium imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBD202</td>
			<td>Compatible controller for MLS203-1 stages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-479/585-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF505/606-Di01-25x36</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-512/25-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-630/92-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Precision T7600</td>
			<td>Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed x-y motorized stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MLS203-1</td>
			<td>Fast XY scannning stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td>For generating 470 nm and 560 nm excitation light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x 2 Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVPLAPO2XC</td>
			<td>Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKDK66 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pKDK66</td>
			<td>Co-injection marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTAK83 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pTAK83</td>
			<td>Plasmid for expression of TagRFP under the control of&#160; the flp-18 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTAK144 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pTAK144</td>
			<td>Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of&#160; the flp-18 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homingback.vi</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National instruments</td>
			<td></td>
			<td>For running tracking software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla Control ver.2.6CI.vi</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium imaging in freely behaving caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration

تؤثر القوى الميكانيكية غير الموضعية ، مثل الاهتزازات والموجات الصوتية ، على مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية من التطور إلى التوازن. الحيوانات تتعامل مع هذه المحفزات عن طريق تعديل سلوكها. يتطلب فهم الآليات الكامنة وراء هذا التعديل السلوكي تحديد كمية النشاط العصبي أثناء سلوك الاهتمام. هنا ، نبلغ عن طريقة لتصوير الكالسيوم في التصرف بحرية Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي بتردد وإزاحة ومدة محددة. تسمح هذه الطريقة بإنتاج اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه جيدا باستخدام محول طاقة صوتي وتحديد كمية استجابات الكالسيوم المستحثة بدقة خلية واحدة. كدليل على المبدأ ، يتم إثبات استجابة الكالسيوم لخلية عصبية داخلية واحدة ، AVA ، أثناء استجابة هروب C. elegans للاهتزاز. سيسهل هذا النظام فهم الآليات العصبية الكامنة وراء الاستجابات السلوكية للمحفزات الميكانيكية.

هنا ، يتم استخدام دودة تعبر عن كل من GCaMP و TagRFP تحت سيطرة المروج الخاص ب AVA interneuron كمثال على تصوير الكالسيوم في التصرف بحرية C. elegans. تم الحصول على بيانات قناة GCaMP و TagRFP كسلسلة من الصور ، بعضها موضح في الشكل 6 وكفيلم (فيلم تكميلي 1). كما تم تحديد إزاحة صفيحة بتري الناجم...

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration at JoVE.com

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

تم الإبلاغ هنا عن نظام لتصوير الكالسيوم في التصرف بحرية Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد. يسمح هذا النظام للباحثين باستحضار الاهتزازات غير الموضعية ذات الخصائص التي يتم التحكم فيها جيدا عند الإزاحة على نطاق النانو وتحديد تيارات الكالسيوم أثناء استجابات C. elegans للاهتزازات.

تصوير الكالسيوم في سلوك حر Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

يسمح نظامنا للباحثين باستثارة الاهتزازات غير الموضعية ذات الخصائص التي يتم التحكم فيها جيدا عند الإزاحة غير المتدرجة وتحديد تيار الكالسيوم أثناء استجابات المهيجات للاهتزازات. كميزة رئيسية لهذه التقنية ، يمكننا التحقيق بشكل غير جراحي في الآليات العصبية ، والآليات الأساسية للسلوك. قم بإعداد وسط نمو نيماتودا جديد أو صفيحة NGM التي يتم فيها رسم الإشريكية القولونية OP50 في نمط مربع باستخدام موزع الخلايا بحيث تقضي الدودة معظم الوقت في البكتيريا أثناء تصوير الكالسيوم.قبل أربعة أيام من تجربة تصوير الكالسيوم، انقل اثنين من ديدان ST12 البالغة إلى اللوحة، وضع الصفيحة في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. قم بإجراء تصوير الكالسيوم باستخدام مجهر مجهز بجهاز محول صوتي للتحفيز ، وعدسة موضوعية 2x ، وكاميرا CMOS عالية السرعة ، وبصريات تقسيم الصور. قم بتشغيل الكمبيوتر الدقيق في وحدة التحكم في المرحلة X Y المزودة بمحرك.ثم قم بتشغيل مكبر الصوت واضبط ضبط مستوى الصوت على 10 في القاعدة وضبط ثلاثة أضعاف على ثمانية. لإثارة GCaMP ووضع علامة على RFP ، قم بتشغيل مصابيح 488 و 560 نانومتر لمصدر ضوء LED. اضبط مقاييس 470 و 550 نانومتر لجراب التحكم في مصدر الضوء على 5٪ بحيث تكون شدة ضوء LED مناسبة للتصوير.قم بتنزيل حزم البرامج والنوافذ التالية وتثبيتها. برنامج ماكرو الماوس ، وبرنامج للتحكم في الاهتزاز ، وبرنامج لتشغيل التتبع ، وبرنامج لتحليل البيانات. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف برنامج التتبع ، ثم اضبط وقت التعرض على 0.033 ثانية ، وقم بالتثبيت على اثنين في اثنين لضمان الحصول على الصور بسلاسة.انقر فوق زر التشغيل وانتظر لمدة خمس دقائق لتحقيق الاستقرار في البرنامج. أدخل المعلومات للحصول على الصورة. على سبيل المثال، لتسجيل 500 صورة بدون فاصل زمني، أدخل 500 في المربع إجمالي الصور، و500 في مربع الصور، وصفر في مربع الفواصل الزمنية.بعد تشغيل زر الاقتناء، قم بتقسيم صورة التألق باستخدام بصريات تقسيم الصورة، وإسقاط قناة GCaMP ووضع علامة على قناة RFP على نصفين من كاميرا CMOS. معايرة إحداثيات GCaMP ووضع علامة على قنوات RFP وحفظ الإعدادات. ثم قم بتعيين الدليل لإخراج ملف البيانات وإيقاف تشغيل عملية الاستحواذ.اقرأ الفحص. ملف نصي مع نظام الماكرو الماوس بحيث يتم التحكم في مؤشر الماوس بناء على الإحداثيات والجدول الزمني في هذا الملف وانقر نقرا مزدوجا فوق ملف البرنامج للتحكم في الاهتزاز. اضبط إحداثيات مؤشر الماوس في وقت الانتظار حتى التحفيز بعد بدء التسجيل، ثم اضبط قيم التردد والسعة في البرنامج للتحكم في الاهتزاز.انقل دودة واحدة تعبر عن كل من GCaMP و RFP من اللوحة المحتضنة إلى لوحة NGM جديدة حيث تم خط E coli OP50. قم بتوصيل لوحة NGM بمحول الطاقة الصوتي باستخدام شريط لاصق شفاف. لتصوير الكالسيوم ، قم بتشغيل زر الاكتساب وابحث عن الدودة عند تكبير 2.5x.اضبط مجال الرؤية على أنه 1.1 × 1.1 ملم بدقة 2.6 ميكرون لكل بكسل. أطفئ الضوء الساطع وانقر على زر التوجيه لتتبع بقعة الفلورسنت للدودة ، والتي تبدأ حركة مرحلة X Y للحفاظ على منطقة الكثافة القصوى للدودة في منتصف مجال الرؤية في صورة طلب تقديم العروض للعلامة. تأكد من أن قيم الكثافة حوالي 1000.إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بضبط مقاييس 470 و 550 نانومتر لجراب التحكم في مصدر الضوء. اضغط على زر التشغيل في نظام الماكرو بالماوس للسماح بالتحكم في مؤشر الماوس، وتحقق من إنشاء ملف BMP الناتج بشكل مناسب. لتحليل البيانات ، قم بإنشاء مجلد على سطح المكتب وتسميته تصوير الكالسيوم"ثم قم بإنشاء مجلد داخل مجلد تصوير الكالسيوم وقم بتسميته نتيجة CI لملفات نتائج الإخراج.انقر نقرا مزدوجا فوق تصوير العرض المزدوج. ملف MB مكتوب في برنامج تحليل البيانات، وأدخل مسارات الملفات في مجلد نتائج CI في المجلد الذي يحتوي على ملف BMP. ادفع مفتاحي shift وReturn في وقت واحد لبدء تحليل تلقائي، والذي يستخدم قيمة منطقة الكثافة القصوى في صورة طلب تقديم العروض للعلامة.أخيرا ، تحقق مما إذا كانت ملفات الإخراج قد تم إنشاؤها بشكل مناسب في مجلد نتائج CI. في التحليل التمثيلي ، تم الحصول على بيانات قناة GCaMP و RFP كسلسلة من الصور. كما تم تحديد كمية إزاحة طبق بتري الناجم عن نظام الاهتزاز غير الموضعي.يمكن التحكم في الإزاحة عن طريق تعيين قيمة السعة في البرنامج للتحكم في الاهتزاز ، وضابط مستوى الصوت ومكبر الصوت. في حين يمكن تنظيم التردد عن طريق تعيين قيمة التردد في البرنامج. لوحظت استجابة كالسيوم عابرة للخلايا العصبية AVA عند التحفيز مع اهتزازات لها تردد 630 هرتز وإزاحة تبلغ حوالي 4.5 ميكرومتر في الثانية ، مما يشير إلى أن خلية Ava العصبية تم تنشيطها أثناء استجابة الدودة الخلفية للتحفيز غير الموضعي.في إجراءنا ، يمكننا تحديد كمية خلية عصبية واحدة فقط. ومع ذلك ، يمكن أيضا دمج هذا النظام مع طريقة التصوير البيومترية لتحديد كمية الخلايا العصبية المتعددة أو حتى الدماغ بأكمله بشكل غير جراحي.

Research

JoVE Journal

Behavior

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (الرنين المغناطيسي الوظيفي) مع التحفيز السمعي في الطيور المغردة

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

التقوية طويلة الأمد من المسار الثاقب-التلفيف المسنن سنبس في يتصرفون بحرية الفئران

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

ثنائي الفوتون التصوير الكالسيوم في الفئران التنقل إلى هذا الشخص واقع البيئة

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Measurement of Vibration Detection Threshold and Tactile Spatial Acuity in Human Subjects

قياس عتبة كشف عن الاهتزاز واللمس المكانية البراعة في الموضوعات الإنسان

Tests that allow the precise determination of psychophysical thresholds for vibration and grating orientation provide valuable information about ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

مقاربة الرواية التجريبية والتحليلية لالمتعدد الوسائط العصبية فك نوايا خلال التفاعل الاجتماعي في التصرف بحرية-الرضع الإنسان

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

متعدد الطبقات الكالسيوم الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; التصوير في الفئران تتحرك بحرية مع تحقيقات بريزم والمصور المجهري مضان

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

جهاز لاسلكي، واجهة ثنائية الاتجاه للتسجيل في فيفو وحفز النشاط العصبي في التصرف بحرية الفئران

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Whole Body Vibration Methods with Survivors of Polio

أساليب اهتزاز الجسم بأكمله مع الناجين من مرض شلل الأطفال

The purpose of the original study was to examine the use of whole body vibration (WBV) on polio survivors with and without post-polio syndrome as a form ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

الشلل الناجم عن السباحة "تقييم إشارات الدوبامين" في ايليجانس كاينورهابديتيس

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

تحليل مقارن للطرق التجريبية لقياس النشاط الحيواني في نماذج Elegans Caenorhabditis من مرض الميتوكوندريا

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...