Name: calcium imaging in freely behaving caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration at JoVE.com

우리는이 연구에 사용 된 균주를 제공 한 Caenorhabditis Genetics Center에 감사드립니다. 이 간행물은 JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), 혁신적인 분야 "소프트 로봇의 과학"프로젝트 (그랜트 번호. JP18H05474), 일본 의학 연구 개발청 (보조금 번호 19gm6110022h001)의 PRIME 및 Shimadzu 재단.

1. 칼슘 이미징까지 웜 재배
<ol><li>칼슘 이미징 실험 4일 전, 두 개의 성인 ST12 웜을 새로운 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트(Table of Materials)로 옮기고, 이 위에 에스케리치아 콜리 OP50이 세포 스프레더를 사용하여 정사각형 패턴(약 4mm x 4mm)으로 줄무늬가 생겨 웜이 칼슘 이미징12 동안 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 합니다.</li>
	<li>이 NGM 플레이트를 ?...

<ol>
	<li>Hill, P. S. M., Wessel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotremology.">Biotremology.</a> Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).</li><li>Fettiplace, R., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+and+motor+roles+of+auditory+hair+cells.">The sensory and motor roles of auditory hair cells.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions.">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).</li><li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeling+force:+physical+and+physiological+principles+enabling+sensory+mechanotransduction.">Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).</li><li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanotransduction.">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+circuit+for+touch+sensitivity+in+Caenorhabditis+elegans.">The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).</li><li>Wicks, S. R., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integration+of+antagonistic+reflexes+revealed+by+laser+ablation+of+identified+neurons+determines+habituation+kinetics+of+the+Caenorhabditis+elegans+tap+withdrawal+response.">The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response.</a> Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).</li><li>Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+new+model+system+for+the+study+of+learning+and+memory.">Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory.</a> Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).</li><li>Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+plasticity+in+a+Caenorhabditis+elegans+mechanosensory+circuit.">Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit.</a> Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).</li><li>Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+optical+quantification+of+mechanosensory+habituation+reveals+neurons+encoding+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+stimulation+method+for+quantifying+C.+elegans+mechanosensory+behavior+and+memory.">Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory.</a> Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).</li><li>Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressional+and+surface+waves+in+sand:+used+by+desert+scorpions+to+locate+prey.">Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey.</a> Science. 197 (4302), 479-482 (1977).</li><li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients.">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).</li><li>Tsukada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+spatial+thermal+gradient+encoded+in+thermosensory+neuron+AFD+in+Caenorhabditis+elegans.">Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).</li><li>Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+circuits+and+synaptic+mechanisms+underlying+motor+initiation+in+C.+elegans.">The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans.</a> Cell. 147 (4), 922-933 (2011).</li><li>Nguyen, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+calcium+imaging+with+cellular+resolution+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans.">Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).</li><li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Prevedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+whole-animal+3D+imaging+of+neuronal+activity+using+light-field+microscopy.">Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy.</a> Nature Methods. 11, 727-730 (2014).</li><li>Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+brain+state+underlies+C.+elegans+sleep+behavior.">A global brain state underlies C. elegans sleep behavior.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+multiple+neurons+in+freely+behaving+C.+elegans.">Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).</li><li>Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+collectively+forms+dynamical+networks.">C. elegans collectively forms dynamical networks.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li></ol>

일반적으로, 신경 활동의 정량화는 동물 신체 움직임에 대한 프로브 및/또는 구속의 도입을 필요로 한다. 그러나 mechanosensory 행동에 대한 연구를 위해, 프로브와 구속의 침습적 도입 자체는 기계적 자극을 구성합니다. C. elegans는 그 특징이 투명하고 302 뉴런 만 포함하는 간단하고 컴팩트 한 신경 회로를 가지고 있기 때문에 이러한 문제를 회피하는 시스템을 제공합니다. 이러한 장점들을 나?...

동물들은 종종 진동 또는 음향파(1,2)와 같은 비국부적인 기계적 자극에 노출된다. 이러한 자극이 항상성, 발달 및 번식에 영향을 미치 기 때문에 동물은 3,4,5에 대처하기 위해 행동을 수정해야합니다. 그러나 이러한 행동 수정의 기초가되는 신경 회로와 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다.
선충류의 Mechanosensory 행동 인 Caenorhabditis elegans는 단순한 행동 패러다임으로, 웜은 일반적으로 비 국소 진동을 만날 때 전진 운동에서 후진 탈출 반응으로 행동을 변경합니다6. 이 행동의 기초가되는 신경 회로는 주로 다섯 개의 감각 뉴런, 네 쌍의 인터뉴런 및 여러 유형의 운동 뉴런 7,8로 구성됩니다. 추가적으로, 웜은 반복적인 자극을 수반하는 이격 훈련 후에 그러한 기계적 자극에 습관화된다 9,10,11. 따라서이 간단한 행동 반응은 비 국소 진동 유발 행동과 기억의 기초가되는 신경 메커니즘을 조사하는 이상적인 시스템을 구성합니다. 비국소 진동의 영향으로 자유롭게 행동하는 웜에서 칼슘 이미징을위한 프로토콜이 설명됩니다. 이전에 보고된 시스템과 비교할 때, 이 시스템은 추적을 위해 추가 카메라가 필요하지 않다는 점에서 간단합니다. 그러나 이를 통해 비국부적 진동의 주파수, 변위 및 지속 시간을 변경할 수 있습니다. AVA 인터뉴런의 활성화는 후진 탈출 반응을 유도하기 때문에, GCaMP, 칼슘 지시약, 및 칼슘-민감하지 않은 형광 단백질인 TagRFP를 공동발현하는 웜을 AVA 특이적 프로모터의 제어 하에 예로 사용하였다(자세한 내용은 표 참조). 이 프로토콜은 웜이 전진에서 후진 운동으로 전환됨에 따라 AVA 뉴런의 활성화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 mechanosensory 행동의 기초가되는 신경 회로 메커니즘을 이해하는 것을 용이하게합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Data anaylsis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DualViewImaging.nb</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of acquired data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mathematica12</td>
			<td>Wolfram</td>
			<td></td>
			<td>For running data anaysis software DualViewImaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli and C. elegans strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lite-1(ce314) strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>KG1180</td>
			<td>Light-insensitive mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter</td>
			<td>author</td>
			<td>ST12</td>
			<td>lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler vibrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lase Doppler vibrometer</td>
			<td>Polytec Japan</td>
			<td>IVS-500</td>
			<td>For quantifying&#160; frequency and displacement generated by the accoustic transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse macro system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay.txt</td>
			<td>Author</td>
			<td></td>
			<td>Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiMacroEx</td>
			<td>Vector</td>
			<td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html</td>
			<td>Free download software for controling mouse cursor based on a script</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth media plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar purified, powder</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01162-15</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto pepton</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211677</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-00485</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>034-03002</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Photassium hydrogenphosphate</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>28727-95</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>20066-95</td>
			<td>For culture of E. coli OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous</td>
			<td>TGI</td>
			<td>M1890</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>28720-65</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>31320-05</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150270</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonlocalized vibration device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>LEPY</td>
			<td>LP-A7USB</td>
			<td>For stimulation with controllable vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic transducer</td>
			<td>MinebeaMitsumi</td>
			<td>LVC25</td>
			<td>For stimulation with controllable vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaveGene Ver. 1.5</td>
			<td>Thrive</td>
			<td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td>
			<td>Free download software for controling vibration property</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noninvasive calcium imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBD202</td>
			<td>Compatible controller for MLS203-1 stages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-479/585-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF505/606-Di01-25x36</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-512/25-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-630/92-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Precision T7600</td>
			<td>Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed x-y motorized stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MLS203-1</td>
			<td>Fast XY scannning stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td>For generating 470 nm and 560 nm excitation light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x 2 Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVPLAPO2XC</td>
			<td>Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKDK66 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pKDK66</td>
			<td>Co-injection marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTAK83 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pTAK83</td>
			<td>Plasmid for expression of TagRFP under the control of&#160; the flp-18 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTAK144 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pTAK144</td>
			<td>Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of&#160; the flp-18 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homingback.vi</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National instruments</td>
			<td></td>
			<td>For running tracking software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla Control ver.2.6CI.vi</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium imaging in freely behaving caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration

진동 및 음향파와 같은 비국부적 인 기계적 힘은 개발에서 항상성에 이르기까지 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칩니다. 동물은 행동을 수정함으로써 이러한 자극에 대처합니다. 이러한 행동 수정의 기초가되는 메커니즘을 이해하려면 관심있는 행동 중 신경 활동의 정량화가 필요합니다. 여기에서, 우리는 특정 주파수, 변위 및 지속 시간의 비 국소 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans 에서 칼슘 이미징 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하면 음향 변환기를 사용하여 잘 제어되고 국부적이지 않은 진동을 생산하고 단일 세포 분해능에서 유발 된 칼슘 반응을 정량화 할 수 있습니다. 원리의 증거로서, 진동에 대한 C. elegans 의 탈출 반응 동안 단일 인터뉴런 인 AVA의 칼슘 반응이 입증됩니다. 이 시스템은 기계적 자극에 대한 행동 반응의 기초가되는 신경 메커니즘에 대한 이해를 촉진 할 것입니다.

여기서, AVA 인터뉴런 특이적 프로모터의 제어 하에 GCaMP 및 TagRFP 둘 다를 발현하는 웜은 자유롭게 행동하는 C. elegans에서 칼슘 이미징의 예로서 사용된다. GCaMP 및 TagRFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 획득되었으며, 이들 중 일부는 도 6 및 영화(보충 무비 1)로서 도시되어 있다. 우리의 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 플레이트의 변위(<strong c...

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Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

우리의 시스템은 연구원들이 비스케일 변위에서 잘 제어되는 특성을 가진 비국부적 진동을 불러일으키고 진동에 대한 자극제의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화할 수 있게 해줍니다. 이 기술의 주요 장점으로, 우리는 비침습적으로 행동의 기본 메커니즘 인 신경 메커니즘을 조사 할 수 있습니다. Escherichia coli OP50이 칼슘 이미징 중에 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 세포 스프레더를 사용하여 사각형 패턴으로 줄무늬가있는 새로운 선충류 성장 배지 또는 NGM 플레이트를 준비하십시오.칼슘 이미징 실험 나흘 전에 성인 ST12 웜 두 개를 플레이트에 옮기고 플레이트를 섭씨 20도 인큐베이터에 나흘 동안 놓습니다. 자극을 위한 음향 트랜스듀서 장치, 2x 대물 렌즈, 고속 CMOS 카메라, 이미지 분할 광학이 장착된 현미경을 사용하여 칼슘 이미징을 수행합니다. X Y 전동 스테이지 컨트롤러에서 정밀 컴퓨터를 켭니다.그런 다음 앰프를 켜고 볼륨 조절기를 베이스에서 10으로 설정하고 고음 조절기를 여덟 개로 설정합니다. GCaMP를 자극하고 RFP에 태그를 지정하려면 LED 광원의 488 및 560 나노 미터 조명을 켭니다. 광원에 있는 제어 포드의 470 및 550 나노미터 게이지를 5%로 설정하여 LED 조명의 강도가 이미징에 적합하도록 합니다.다음 소프트웨어 패키지 및 창을 다운로드하여 설치합니다. 마우스 매크로 소프트웨어, 진동 제어 소프트웨어, 추적 실행 소프트웨어 및 데이터 분석용 소프트웨어. 추적 소프트웨어 파일을 두 번 클릭 한 다음 노출 시간을 0.033 초로 설정하고 두 개씩 비닝하여 원활한 이미지 수집을 보장합니다.실행 버튼을 클릭하고 소프트웨어를 안정화하기 위해 다섯 분 동안 기다립니다. 이미지 수집을 위한 정보를 입력합니다. 예를 들어 간격 없이 500개의 이미지를 기록하려면 이미지 합계 상자에 500을, 이미지 상자에 500을, 간격 상자에 0을 입력합니다.획득 버튼을 켠 후 이미지 분할 광학을 사용하여 형광 이미지를 분할하고 GCaMP 채널을 투사하고 RFP 채널을 CMOS 카메라의 두 반쪽에 태그합니다. GCaMP의 좌표를 보정하고 RFP 채널에 태그를 지정하고 설정을 저장합니다. 그런 다음 데이터 파일을 출력하고 수집을 끄도록 디렉토리를 설정하십시오.분석을 읽으십시오. 마우스 매크로 시스템이있는 텍스트 파일을 사용하여 마우스 커서가 해당 파일의 좌표와 일정에 따라 제어되고 진동 제어를 위해 소프트웨어 파일을 두 번 클릭하십시오. 기록을 시작한 후 자극까지 대기 시간에 마우스 커서의 좌표를 설정 한 다음 진동 제어를 위해 소프트웨어에서 주파수와 진폭 값을 설정하십시오.GCaMP 및 태그 RFP를 모두 발현하는 단일 웜을 인큐베이션 플레이트에서 E coli OP50이 줄무늬가 있는 신선한 NGM 플레이트로 옮깁니다. 투명 접착 테이프를 사용하여 NGM 플레이트를 음향 트랜스듀서에 부착합니다. 칼슘 이미징의 경우 수집 버튼을 켜고 2.5x 배율로 웜을 찾으십시오.시야각을 픽셀당 2.6미크론의 해상도로 1.1 x 1.1밀리미터로 설정합니다. 밝은 빛을 끄고 호밍 버튼을 클릭하여 웜의 형광 스폿을 추적하면 X Y 단계의 이동이 시작되어 태그 RFP 이미지의 시야각 중간에 웜의 최대 강도 영역을 유지합니다. 강도 값이 약 1000인지 확인하십시오.그렇지 않은 경우 광원에서 제어 포드의 470 및 550 나노 미터 게이지를 미세 조정하십시오. 마우스 매크로 시스템에서 실행 단추를 눌러 마우스 커서 제어를 허용하고 출력 BMP 파일이 적절하게 생성되었는지 확인합니다. 데이터 분석을 위해 바탕 화면에 폴더를 만들고 이름을 Calcium Imaging"으로 지정한 다음 Calcium Imaging 폴더 안에 폴더를 만들고 출력 결과 파일의 이름을 CI result로 지정합니다.듀얼 뷰 이미징을 두 번 클릭합니다. MB 파일은 데이터 분석 소프트웨어에 기록되고, BMP 파일이 있는 폴더에 CI 결과 폴더에 파일 경로를 삽입한다. 시프트와 리턴 키를 동시에 눌러 태그 RFP 이미지에서 최대 강도 영역의 값을 사용하는 자동 분석을 시작합니다.마지막으로 출력 파일이 CI 결과 폴더에 적절하게 생성되었는지 확인하십시오. 대표적인 분석에서, GCaMP 및 태그 RFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 얻어졌다. 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 접시의 변위도 또한 정량화되었다.변위는 진동 제어를위한 소프트웨어에서 진폭 값을 설정하고 볼륨 조절기 및 증폭기를 설정하여 제어 할 수 있습니다. 반면 주파수는 소프트웨어에서 주파수 값을 설정하여 조정할 수 있습니다. AVA 뉴런의 일시적인 칼슘 반응은 630 헤르츠의 주파수와 초당 약 4.5 마이크로미터의 변위를 갖는 진동으로 자극시 관찰되었으며, 이는 아바 뉴런이 비국소 자극에 대한 웜의 후진 반응 중에 활성화되었음을 나타낸다.우리의 절차에서, 우리는 단지 하나의 뉴런을 정량화 할 수 있습니다. 그러나이 시스템은 생체 인식 이미징 방법과 결합하여 비침습적으로 여러 뉴런 또는 심지어 전체 뇌를 정량화 할 수도 있습니다.

Research

JoVE Journal

Behavior

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

명금의 청각 자극 기능성 자기 공명 영상 (fMRI)

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

연구

행동분석학

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

자유롭게 마우스를 동작에 문제가있는 Perforant 통로 - 치아 이랑 (dentate gyrus) 시냅스의 장기 강화 작용

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Measurement of Vibration Detection Threshold and Tactile Spatial Acuity in Human Subjects

인간 주제에 진동 감지 임계 값과 촉각 공간 시력 측정

Tests that allow the precise determination of psychophysical thresholds for vibration and grating orientation provide valuable information about ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

인간의 유아를 자유롭게 행동의 사회적 상호 작용하는 동안 의도 모드의 신경 디코딩에 소설 실험 및 분석 접근

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Whole Body Vibration Methods with Survivors of Polio

소아마비 생존자와 함께 몸 전체 진동 방법

The purpose of the original study was to examine the use of whole body vibration (WBV) on polio survivors with and without post-polio syndrome as a form ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...