Name: calcium imaging in freely behaving caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration at JoVE.com

Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis por proporcionar las cepas utilizadas en este estudio. Esta publicación fue apoyada por JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sobre áreas innovadoras del proyecto "Science of Soft Robot" (Grant no. JP18H05474), el PRIME de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (número de subvención 19gm6110022h001), y la fundación Shimadzu.

1. Cultivo de gusanos hasta la obtención de imágenes de calcio
<ol><li>Cuatro días antes de un experimento de imágenes de calcio, transfiera dos gusanos ST12 adultos a una nueva placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) (Tabla de Materiales) en la que Escherichia coli OP50 se rayan en un patrón cuadrado (aproximadamente 4 mm x 4 mm) utilizando un esparcidor celular para que el gusano pase la mayor parte del tiempo en la bacteria durante las imágenes de calcio12</...

<ol>
	<li>Hill, P. S. M., Wessel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotremology.">Biotremology.</a> Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).</li><li>Fettiplace, R., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+and+motor+roles+of+auditory+hair+cells.">The sensory and motor roles of auditory hair cells.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions.">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).</li><li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeling+force:+physical+and+physiological+principles+enabling+sensory+mechanotransduction.">Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).</li><li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanotransduction.">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).</li><li>Goodman, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+plasticity+in+a+Caenorhabditis+elegans+mechanosensory+circuit.">Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit.</a> Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).</li><li>Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+optical+quantification+of+mechanosensory+habituation+reveals+neurons+encoding+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+stimulation+method+for+quantifying+C.+elegans+mechanosensory+behavior+and+memory.">Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory.</a> Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).</li><li>Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressional+and+surface+waves+in+sand:+used+by+desert+scorpions+to+locate+prey.">Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey.</a> Science. 197 (4302), 479-482 (1977).</li><li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients.">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).</li><li>Tsukada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+spatial+thermal+gradient+encoded+in+thermosensory+neuron+AFD+in+Caenorhabditis+elegans.">Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).</li><li>Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+circuits+and+synaptic+mechanisms+underlying+motor+initiation+in+C.+elegans.">The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans.</a> Cell. 147 (4), 922-933 (2011).</li><li>Nguyen, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+calcium+imaging+with+cellular+resolution+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans.">Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).</li><li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Prevedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+whole-animal+3D+imaging+of+neuronal+activity+using+light-field+microscopy.">Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy.</a> Nature Methods. 11, 727-730 (2014).</li><li>Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+brain+state+underlies+C.+elegans+sleep+behavior.">A global brain state underlies C. elegans sleep behavior.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+multiple+neurons+in+freely+behaving+C.+elegans.">Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).</li><li>Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+collectively+forms+dynamical+networks.">C. elegans collectively forms dynamical networks.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li></ol>

En general, la cuantificación de la actividad neuronal requiere la introducción de una sonda y / o restricciones en el movimiento del cuerpo animal. Sin embargo, para los estudios del comportamiento mecanosensorial, la introducción invasiva de una sonda y las restricciones en sí mismas constituyen estímulos mecánicos. C. elegans proporciona un sistema para eludir estos problemas, porque sus características son transparentes y porque tiene un circuito neuronal simple y compacto que comprende solo 302 neuro...

Los animales suelen estar expuestos a estímulos mecánicos no localizados como vibraciones u ondas acústicas 1,2. Debido a que estos estímulos influyen en la homeostasis, el desarrollo y la reproducción, los animales deben modificar sus comportamientos para hacerles frente 3,4,5. Sin embargo, los circuitos neuronales y los mecanismos que subyacen a dicha modificación del comportamiento son poco conocidos.
El comportamiento mecanosensorial en el nematodo, Caenorhabditis elegans, es un paradigma conductual simple, en el que los gusanos generalmente cambian el comportamiento de un movimiento hacia adelante a una respuesta de escape hacia atrás cuando se encuentran con vibración no localizada6. El circuito neuronal subyacente a este comportamiento se compone principalmente de cinco neuronas sensoriales, cuatro pares de interneuronas y varios tipos de neuronas motoras 7,8. Además, los gusanos se habitúan a tales estímulos mecánicos después de un entrenamiento espaciado que implica estimulación repetida 9,10,11. Por lo tanto, esta respuesta conductual simple constituye un sistema ideal para investigar los mecanismos neuronales subyacentes tanto al comportamiento evocado por vibración no localizada como a la memoria. Se ilustra un protocolo para imágenes de calcio en gusanos que se comportan libremente bajo la influencia de vibraciones no localizadas. En comparación con los sistemas informados anteriormente, este sistema es simple en el sentido de que no requiere una cámara adicional para el seguimiento; sin embargo, nos permite cambiar la frecuencia, el desplazamiento y la duración de la vibración no localizada. Debido a que la activación de las interneuronas AVA induce la respuesta de escape hacia atrás, se utilizaron como ejemplo los gusanos que coexpresan GCaMP, un indicador de calcio, y TagRFP, una proteína fluorescente insensible al calcio, bajo el control de un promotor específico de AVA (ver Tabla de Materiales para más detalles). El protocolo demuestra la activación de las neuronas AVA a medida que un gusano cambia de movimiento hacia adelante hacia atrás. Este protocolo facilita la comprensión del mecanismo del circuito neuronal subyacente al comportamiento mecanosensorial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Data anaylsis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DualViewImaging.nb</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of acquired data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mathematica12</td>
			<td>Wolfram</td>
			<td></td>
			<td>For running data anaysis software DualViewImaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli and C. elegans strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lite-1(ce314) strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>KG1180</td>
			<td>Light-insensitive mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter</td>
			<td>author</td>
			<td>ST12</td>
			<td>lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler vibrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lase Doppler vibrometer</td>
			<td>Polytec Japan</td>
			<td>IVS-500</td>
			<td>For quantifying&#160; frequency and displacement generated by the accoustic transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse macro system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay.txt</td>
			<td>Author</td>
			<td></td>
			<td>Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiMacroEx</td>
			<td>Vector</td>
			<td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html</td>
			<td>Free download software for controling mouse cursor based on a script</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth media plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar purified, powder</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01162-15</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto pepton</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211677</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-00485</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>034-03002</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Photassium hydrogenphosphate</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>28727-95</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>20066-95</td>
			<td>For culture of E. coli OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous</td>
			<td>TGI</td>
			<td>M1890</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>28720-65</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>31320-05</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150270</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonlocalized vibration device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>LEPY</td>
			<td>LP-A7USB</td>
			<td>For stimulation with controllable vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic transducer</td>
			<td>MinebeaMitsumi</td>
			<td>LVC25</td>
			<td>For stimulation with controllable vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaveGene Ver. 1.5</td>
			<td>Thrive</td>
			<td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td>
			<td>Free download software for controling vibration property</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noninvasive calcium imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBD202</td>
			<td>Compatible controller for MLS203-1 stages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-479/585-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF505/606-Di01-25x36</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-512/25-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-630/92-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Precision T7600</td>
			<td>Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed x-y motorized stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MLS203-1</td>
			<td>Fast XY scannning stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td>For generating 470 nm and 560 nm excitation light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x 2 Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVPLAPO2XC</td>
			<td>Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKDK66 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pKDK66</td>
			<td>Co-injection marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTAK83 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pTAK83</td>
			<td>Plasmid for expression of TagRFP under the control of&#160; the flp-18 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTAK144 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pTAK144</td>
			<td>Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of&#160; the flp-18 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homingback.vi</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National instruments</td>
			<td></td>
			<td>For running tracking software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla Control ver.2.6CI.vi</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium imaging in freely behaving caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration

Las fuerzas mecánicas no localizadas, como las vibraciones y las ondas acústicas, influyen en una amplia variedad de procesos biológicos desde el desarrollo hasta la homeostasis. Los animales hacen frente a estos estímulos modificando su comportamiento. Comprender los mecanismos subyacentes a dicha modificación del comportamiento requiere la cuantificación de la actividad neuronal durante el comportamiento de interés. Aquí, informamos un método para la obtención de imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada de frecuencia, desplazamiento y duración específicos. Este método permite la producción de vibraciones bien controladas y no localizadas utilizando un transductor acústico y la cuantificación de las respuestas de calcio evocadas a resolución de una sola célula. Como prueba de principio, se demuestra la respuesta de calcio de una sola interneurona, AVA, durante la respuesta de escape de C. elegans a la vibración. Este sistema facilitará la comprensión de los mecanismos neuronales subyacentes a las respuestas conductuales a los estímulos mecánicos.

Aquí, un gusano que expresa tanto GCaMP como TagRFP bajo el control del promotor específico de interneurona AVA se utiliza como ejemplo de imágenes de calcio en C. elegans que se comporta libremente. Los datos de los canales GCaMP y TagRFP se obtuvieron como una serie de imágenes, algunas de las cuales se muestran en la Figura 6 y como una película (Película suplementaria 1). También se cuantificó el desplazamiento de la placa de Petri inducido por nuestro s...

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Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Aquí se informa un sistema para imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans que se comportan libremente con vibración bien controlada y no localizada. Este sistema permite a los investigadores evocar vibraciones no localizadas con propiedades bien controladas a un desplazamiento a nanoescala y cuantificar las corrientes de calcio durante las respuestas de C. elegans a las vibraciones.

Imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada y bien controlada

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Nuestro sistema permite a los investigadores evocar vibraciones no localizadas con propiedades bien controladas a desplazamiento no escalado y cuantificar la corriente de calcio durante las respuestas de los irritantes a las vibraciones. Como principal ventaja de esta técnica, podemos investigar de forma no invasiva los mecanismos neuronales, mecanismos subyacentes del comportamiento. Prepare un nuevo medio de crecimiento de nematodos o placa NGM en la que Escherichia coli OP50 esté rayada en un patrón cuadrado utilizando un esparcidor celular para que el gusano pase la mayor parte del tiempo en las bacterias durante las imágenes de calcio.Cuatro días antes de un experimento de imágenes de calcio, transfiera dos gusanos ST12 adultos a la placa y coloque la placa en una incubadora de 20 grados Celsius durante cuatro días. Realice imágenes de calcio utilizando un microscopio equipado con un dispositivo de transductor acústico para la estimulación, una lente de objetivo 2x, una cámara CMOS de alta velocidad, óptica de división de imágenes. Encienda la computadora de precisión en el controlador de etapa motorizado X Y.Luego encienda el amplificador y ajuste el ajustador de volumen a 10 en la base y los ajustadores de agudos a ocho. Para excitar GCaMP y etiquetar RFP, encienda las luces de 488 y 560 nanómetros de la fuente de luz LED. Ajuste los medidores de 470 y 550 nanómetros de la cápsula de control en la fuente de luz al 5% para que la intensidad de la luz LED sea adecuada para la obtención de imágenes.Descargue e instale los siguientes paquetes de software y ventanas. Software de macros de ratón, software para control de vibraciones, software para seguimiento de ejecución y software para análisis de datos. Haga doble clic en el archivo de software de seguimiento, luego establezca el tiempo de exposición en 0.033 segundos y se vincule a dos por dos para garantizar una adquisición de imagen sin problemas.Haga clic en el botón ejecutar y espere cinco minutos para estabilizar el software. Introduzca la información para la adquisición de imágenes. Por ejemplo, para grabar 500 imágenes sin un intervalo, escriba 500 en el cuadro total de imágenes, 500 en el cuadro de imágenes y cero en el cuadro intervalos.Después de activar el botón de adquisición, divida la imagen de fluorescencia utilizando la óptica de división de imágenes, proyectando el canal GCaMP y etiquete el canal RFP en dos mitades de la cámara CMOS. Calibre las coordenadas del GCaMP y etiquete los canales RFP y guarde la configuración. A continuación, configure el directorio para generar el archivo de datos y desactive la adquisición.Lea el ensayo. archivo de texto con el sistema de macros del ratón para que el cursor del ratón se controle en función de las coordenadas y la programación en ese archivo y haga doble clic en el archivo de software para el control de vibraciones. Establezca las coordenadas del cursor del mouse en tiempo de espera hasta la estimulación después de iniciar la grabación, luego configure la frecuencia y los valores de amplitud en el software para el control de vibraciones.Transfiera un solo gusano que exprese tanto GCaMP como etiqueta RFP desde la placa incubada a una placa NGM fresca donde E coli OP50 ha sido rayada. Conecte la placa NGM al transductor acústico con cinta adhesiva transparente. Para obtener imágenes de calcio, active el botón de adquisición y busque el gusano con un aumento de 2.5x.Establezca el campo de visión como 1,1 por 1,1 milímetros con una resolución de 2,6 micras por píxel. Apague la luz brillante y haga clic en el botón de búsqueda para rastrear el punto fluorescente de un gusano, que inicia el movimiento de la etapa X Y para mantener la región de máxima intensidad del gusano en el medio del campo de visión en la imagen RFP de la etiqueta. Asegúrese de que los valores de intensidad sean aproximadamente 1000.De lo contrario, ajuste los medidores de 470 y 550 nanómetros de la cápsula de control en la fuente de luz. Presione el botón ejecutar en el sistema de macros del mouse para permitir el control del cursor del mouse y verifique que el archivo BMP de salida se haya creado correctamente. Para el análisis de datos, cree una carpeta en el escritorio y asígnele el nombre Calcium Imaging"luego cree una carpeta dentro de la carpeta Calcium Imaging y asígnele el nombre de resultado CI para los archivos de resultados de salida.Haga doble clic en la imagen de vista dual. MB escrito en el software de análisis de datos e inserte las rutas de archivo a la carpeta de resultados de CI en la carpeta con el archivo BMP. Presione las teclas shift y return simultáneamente para iniciar un análisis automático, que utiliza el valor de una región de máxima intensidad en la imagen RFP de la etiqueta.Finalmente, verifique si los archivos de salida se crean correctamente en la carpeta de resultados de CI. En el análisis representativo, se obtuvieron datos de canales GCaMP y TAG RFP como una serie de imágenes. También se cuantificó el desplazamiento de la placa de Petri inducido por un sistema de vibración no localizado.El desplazamiento se puede controlar estableciendo el valor de amplitud en el software para el control de vibraciones, y el ajustador de volumen y el amplificador. Mientras que la frecuencia se puede regular estableciendo el valor de frecuencia en el software. Se observó una respuesta transitoria de calcio de las neuronas AVA tras la estimulación con vibraciones que tenían una frecuencia de 630 Hertz y un desplazamiento de aproximadamente 4,5 micrómetros por segundo, lo que indica que la neurona Ava se activó durante la respuesta hacia atrás de un gusano a la estimulación no localizada.En nuestro procedimiento, podemos cuantificar una sola neurona. Sin embargo, este sistema también se puede combinar con un método de imágenes biométricas para cuantificar de forma no invasiva múltiples neuronas o incluso todo el cerebro.

Research

JoVE Journal

Behavior

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

Resonancia magnética funcional (fMRI) con estimulación auditiva en Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Investigación

Comportamiento

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

La potenciación a largo plazo de la Vía Perforante-giro dentado sinapsis en comportarse libremente Ratones

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Measurement of Vibration Detection Threshold and Tactile Spatial Acuity in Human Subjects

La medición de Umbral de detección de vibraciones y táctil espacial Agudeza en sujetos humanos

Tests that allow the precise determination of psychophysical thresholds for vibration and grating orientation provide valuable information about ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

Un nuevo enfoque experimental y analítico al Multimodal Neural Decodificación de Intención Durante interacción social en Libremente-comportarse Infantes Humanos

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Un inalámbrico, interfaz bidireccional para la grabación en Vivo y estimulación de la actividad Neural en comportarse libremente las ratas

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Whole Body Vibration Methods with Survivors of Polio

Métodos de vibración de cuerpo entero con sobrevivientes de la poliomielitis

The purpose of the original study was to examine the use of whole body vibration (WBV) on polio survivors with and without post-polio syndrome as a form ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...