Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية جوائز البحوث السلوكية البيولوجية للعلماء الجدد المبتكرين (BRAINS) جائزة R01MH113858 (إلى R.K.) ، وهي المعاهد الوطنية للصحة جائزة KL2 TR002542 (PL). A المعهد الوطني للصحة العقلية جائزة تطوير العلماء السريرية K08MH086846 (لR.K.) ، وسيدني R Baer الابن منحة مؤسسة (ل. ل) دوريس الخيرية جائزة تطوير العلماء السريرية (لR.K.) ، وريان ليخت سانج ثنائية القطب مؤسسة (إلى R.K.) ، وفيليس & مؤسسة جيروم لايل رابابورت (إلى R.K.)، ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية (إلى R.K.) وستيف ويليس وإليسا فرويد (إلى R.K.). نشكر الدكتورة آني كاثروريا على قراءتها النقدية وردود الفعل على المخطوطة.

تمت إعادة برمجة iPSCs الإنسان من الخلايا الليفية من المتبرعين الأصحاء باستخدام بروتوكول وافق عليه المجلسين مراجعة المؤسسات من مستشفى ماساتشوستس العام ومستشفى ماكلين, وتتميز كما وصف في الدراسات السابقة44,45,46.
ملاحظة: باختصار?...

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
في هذا البروتوكول، قمنا بإجراء بعض التعديلات في استخدام مصفوفة خارج الخلية شائعة الاستخدام والخلايا وسائل الإعلام ثقافة خلال زراعة iPSC لاشتقاق BMECs(الشكل 1). لم تؤثر هذه التغييرات على القدرة على اشتقاق BMECS من iPSCs ا?...

وظيفة حاجز الدم في الدماغ يشكل حاجز الدم في الدماغ (BBB) حدًا يحد من حركة المواد من الدم إلى الدماغ. وBBB يتكون من خلايا البطاخلية الدقيقة في الدماغ (BMECs) التي تشكل أحادية الطبقة بطانة الأوعية الدموية. BMECs، جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية، والخلايا العصبية، وال بيريكيتس، microglia، ومصفوفة خارج الخلية، تشكل وحدة الأوعية العصبية. BMECs لديها هيكل شبه الخلايا المنظمة بإحكام يسمح BBB للحفاظ على مقاومة كهربائية عالية عبر ال endothelial (TEER) ، مما يحد من الانتشار السلبي ويعمل كمؤشر على سلامة الحاجز1،2. BMECs أيضا البروتينات التي تساعد في الحركة عبر الخلية مثل الاندوس، transcytosis، والهجرة، فضلا عن البذخ من الكريات البيض خلال استجابة مناعية3. تعتمد BMECs على تدفق و efflux الناقلين للتغذية وإزالة النفايات المنتجات، من أجل الحفاظ على التوازن المثلي في الدماغ3. على سبيل المثال، المنقول الناقل الأسرة 2 عضو 1 (SLC2A1) هو ناقل تدفق المسؤولة عن حركة الجلوكوز عبر BBB4، في حين أن الناقلين efflux مثل ATP ربط الكاسيت B عضو 1 (ABCB1) و ATP ربط الكاسيت الفرعي C عضو 1 (ABCC1) هي المسؤولة عن العودة الركائز مرة أخرى إلى مجرى الدم3،5،6،7. ABCB1 ركائز تشمل المورفين, فيراباميل4, ومضادات الذهان مثل olanzapine وrisperidone8, في حين أن الناقل ABCC1 لديه مجموعة متنوعة من ركائز بما في ذلك المتقارنات كبريتات, vincristine, وglucuronide conjugates4.
تطبيق نماذج BBB في الاضطرابات النفسية وقد تورط الخلل BBB في عدد من الاضطرابات العصبية والنفسية, بما في ذلك الفصام والاضطراب ثنائي القطب9,10. في الآونة الأخيرة ، iPSC المستمدة من النماذج الخلوية السابقة vivo تستخدم لاستجواب الأسس الخلوية والجزيئية من الاضطرابات النفسية ، ولكن هذه النماذج حاليا لا تأخذ في الاعتبار الدور المحتمل الذي تضطلع به neurovasculature11،12،13. هو افتراض أن السيتوكينات الالتهابية الطرفية المتداولة في الدم يمكن أن تؤثر سلبا على BBB14،15،16،17، ولكن هناك أيضا أدلة على18شبه الخلية،19،20،21،2122,عبر الخلية23,24,25,26,27,28,29, ومصفوفة خارج الخلية20,29,30,31,32 تشوهات تساهم في خلل BBB. يمكن أن يؤدي تعطيل BBB إلى دخول محتويات الدم إلى الدماغ وproenchyma وتفعيل الخلايا الفلكية و /أو microglia لإطلاق السيتوكينات البروينفلورية ، والتي بدورها تبدأ استجابة التهابية33 التي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على الدماغ34. BMECs هي المكون الرئيسي لBBB ودراسة هيكل ووظيفة هذه الخلايا يمكن أن تعزز فهم الخلل BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية.
نماذج BMEC البديلة قبل تطوير بروتوكولات فعالة لاشتقاق BMECs من iPSCs1,6,35,36, كان الباحثون قد استخدموا BMECs37 الخالدة لدراسة وظيفة BBB. ومع ذلك، فشل العديد من هذه النماذج لتحقيق المرغوب فيه BBB الظاهريات، مثل هذا النطاق الفسيولوجية من القيم38،39. 2- والاستفادة من مراكز الـ iPSCs هي ميزة الاحتفاظ بالخلفية الوراثية للفرد الذي تُستمد منه الخلايا. يعمل العلماء بنشاط على إنشاء نماذج البيئة الدقيقة المستمدة من iPSC التي تُخص بنية ووظيفة الدماغ البشري. وقد طور الباحثون أساليب لاشتقاق BMECs التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا BMECs الموجودة في الجسم الحي. تتطلب طرق الحصول على مجموعات منقّاة من BMECs المشتقة من iPSC عددًا من الخطوات المختلفة مع بروتوكولات يتم تحسينها في السنوات القليلة الماضية1و6و35و36. عموما, iPSC المشتقة من BMECs هي مثقف في الأساسية 6 (E6) المتوسطة لمدة 4 أيام, تليها 2 أيام في الإنسان endothelial المصل خالية من المتوسطة (hESFM) تكمل مع عامل النمو الليفي الأساسي (bFGF), حمض الريتينيك (RA), و B27 الملحق. ثم يتم استزراع الخلايا على الكولاجين الرابع (COL4) ومصفوفة فيبرومينيكتان (FN) للحصول على > 90٪ BMECs متجانسة1.
يتم تأكيد هوية BMECs عن طريق الفلوروس المغناطيسية التي تظهر التعبير المشترك لبروتينات BMEC بما في ذلك جزيء التصاق الخلايا البطانية الصفائح الدموية -1 (PECAM1) وSLC2A1 والبروتينات الضيقة مثل وصلة الوصل الضيقة البروتين 1 (TJP1) ، occludin (OCLN) ، وكلاودن -5 (CLDN5)6. وقد استخدمت مقايسات النتـر للتأكد من الإمكانات الـ أوعية للـ iPSC المشتقة من BMECs. 6 يتم تقييم سلامة BBB من BMECs من خلال وجود قيم فيزيولوجية في المختبر TEER (~20000Ω × سم2)37 ونشاط قابل للقياس لنقل efflux مثل ABCB1 وBCC11،6،36. وقد أدت التطورات المنهجية الأخيرة من قبل مجموعة ليبمان إلى بروتوكولات BMEC المشتقة من iPSC مع تقليل التغير التجريبي وتعزيز قابلية التكاثر1. ومع ذلك، لا يُعرف ما إذا كان من الممكن توسيعها وتجاوزها إلى ما بعد مرحلة الاستزراع الفرعي. يهدف بروتوكولنا المعدل إلى معالجة هذه المشكلة عن طريق تمرير BMECs المشتقة من iPSC إلى ما بعد اليوم الثامن وتقييم ما إذا كان يمكن توسيعها بشكل أكبر للاحتفاظ بخصائص BBB بعد الحفظ بالتبريد. في حين لم تصف أي دراسات تمرير BMECs المشتقة من iPSC ، يوجد بروتوكول للحفظ بالتبريد BMEC الذي يحتفظ بخصائص BBB الفسيولوجية بعد خضوعه لدورة التجميد40. ومع ذلك، فإنه غير معروف BMECs ما بعد التبريد يمكن أن يكون ممر والاحتفاظ بخصائص BBB.
BMECs المستمدة من iPSCs باستخدام بروتوكول ليبمان وقد استخدمت لنموذج اضطراب BBB في الاضطرابات العصبية مثل مرض هنتنغتون7. وقد استخدمت هذه BMECs مشتقة من iPSC أيضا للتحقيق في آثار العدوى البكتيرية مثل التهاب السحايا Neisseria أو المجموعة B العقدية على تعطيل حاجز CSF الدم وBBB على التوالي41,42. أيضا، باستخدام BMECs المشتقة من iPSC من مرضى متلازمة الحذف 22q الذين يعانون من الفصام، لاحظ الباحثون زيادة في جزيء التصاق بين الخلايا-1 (ICAM-1)، وهو جزيء التصاق كبير في BMECs التي تساعد في التوظيف والبذخ من الكريات البيض في الدماغ43. هذه الدراسات مجتمعة، تثبت فائدة BMECs المشتقة من iPSC لدراسة اضطراب BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية المعقدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

يمكن تمييز الخلايا البطاخلية الدقيقة في الدماغ (BMECs) عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريًا (iPSCs) لتطوير نماذج خلوية سابقة للدماغ (BBB) لدراسة حاجز الدم في الدماغ. ويوفر هذا البروتوكول المعدل خطوات تفصيلية لاشتقاق وتوسيع وتكرير BMECs من مراكز iPSCs البشرية باستخدام متبرع وكاشفات مختلفة عن تلك التي تم الإبلاغ عنها في البروتوكولات السابقة. يتم التعامل مع iPSCs مع الأساسية 6 المتوسطة لمدة 4 أيام، تليها 2 أيام من endothelial الإنسان خالية من المصل المتوسطة المتوسطة تكملها عامل النمو الليفي الأساسي، حمض الريتينويك، وتكملة B27. في اليوم 6، الخلايا هي تحت-مثقف على مصفوفة الكولاجين/فيبرومينكتين لمدة 2 أيام. يتم إجراء الكيمياء المناعية في اليوم 8 لتحليل علامة BMEC باستخدام CLDN5 و OCLN و TJP1 و PECAM1 و SLC2A1. يتم تنفيذ النشاف الغربي لتأكيد تعبير علامة BMEC ، وغياب SOX17 ، وهي علامة ادمرمة. ويتضح احتمال أنجيوجينيك مع فحص تنبت. يتم قياس المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم (TEER) باستخدام أقطاب عيدان الطعام ومقياس الفولث بدءاً من اليوم السابع. يتم قياس نشاط النقل Efflux لـ ATP ربط كاسيت subfamily B عضو 1 ATP ربط كاسيت subfamily عضو C 1 باستخدام قارئ لوحة متعددة في اليوم 8. ويؤكد الاشتقاق الناجح لـ BMECs وجود علامات الخلية ذات الصلة، وانخفاض مستويات SOX17، وإمكانية التشغية، ونشاط الناقل، وقيم TEER ~ 2000 Ω × سم2. يتم توسيع BMECs حتى اليوم 10 قبل تمرير على لوحات الكولاجين المطلية حديثا / فيبرومينكين أو cryopreserved. يوضح هذا البروتوكول أنه يمكن توسيع BMECs المشتقة من iPSC و تمريرها مرة واحدة على الأقل. ومع ذلك، فقد لوحظت قيم أقل من TEER وتعريب أقل لعلامات BMEC بعد الحفظ بالتبريد. يمكن استخدام BMECs في تجارب الثقافة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى (الخلايا العصبية ، glia ، pericytes)، في نماذج الدماغ ثلاثية الأبعاد (رقاقة الجهاز والهيدروجيل) ، لإضفاء الطابع الوعائي على الأعضاء في الدماغ ، ولدراسة الخلل في خلل BBB في الاضطرابات النفسية العصبية.

تمايز BMEC وينبغي اتباع بعض الخطوات الهامة في هذا البروتوكول بدقة(الشكل 1). E6 متوسطة الاستخدام في اليوم 1 مهم، لأنه غالبا ما يستخدم لاشتقاق نسب العصبية من iPSCs خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن تسفر عن نتائج استنساخ عبر خطوط الخلايا المتعددة36. وثمة خطوة هام?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مكيفة لاشتقاق, توسيع, و cryopreserve خلايا البطانية الأوعية الدموية المجهرية التي تم الحصول عليها عن طريق التمييز بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات الناجمة عن النشاط البشري, ودراسة خصائص حاجز الدم في الدماغ في نموذج الجسم الحي السابق.

اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

BMECs generated from iPSC provide new experimental models for studying blood brain barrier function and dysfunction. We have used this protocol to examine whether BMECs retain their barrier properties after expansion and cryopreservation. This technique enables the generation of disease-specific BMECs from patients with disorders in which blood-brain barrier disruption plays a role in the pathophysiology of disease.To induce BMEC differentiation from human iPSCs, wash the confluent iPSC culture with DPBS one time before incubating the cells with the appropriate volume of enzymatic EDTA for approximately five minutes at 37 degrees Celsius. When a single cell suspension has been obtained collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in an appropriate volume of stem cell medium supplemented with 10 micromolar ROCK inhibitor for counting. Dilute the cells to 1.56 times 10 to the fourth cells per cubic centimeter concentration and seed two milliliters of cells into individual wells of a six-well flat bottom.After 24 hours in the cell culture incubator replace the supernatant in each well with E6 medium and return the plate to the incubator for four more days. To purify the iPSC-derived BMECs, coat the subculturing plates with the appropriate volume of a freshly prepared collagen IV and fibronectin solution per well and incubate the plates for a minimum of two hours at 37 degrees Celsius. On day six of differentiation collect the cells by centrifugation and resuspend the pellets in the appropriate volume of fresh human endothelial serum-free medium supplemented with B27, basic fibroblasts growth factor, and retinoic acid.For TEER analysis, plate the differentiated cells into each well of a collagen and fibronectin coated 12-transwell filtered plate. For efflux transporter activity analysis, plate the cells into each well of a collagen and fibronectin coated 24-well flat bottom plate. After 24 hours of subculture, replace the supernatant in each well with fresh human endothelial serum-free medium supplemented only with B27 supplement.To measure the blood brain barrier properties of the BMECs using TEER, charge the TEER instrument overnight and lightly wipe the instrument and chopstick electrodes with 70%ethanol before placing them into the safety hood. Switch on the power and calibrate the ohm meter according to the manufacturer's specifications. Plug in the electrodes and rinse them one time with 70%ethanol and one time with DPBS.Place the shorter end of the electrode into the atypical chamber of the insert and the longer end into the basolateral chamber of a blank well. After measuring the negative control response, quickly rinse the electrodes as demonstrated and measure the first experimental well. After all of the measurements have been recorded rinse chopstick electrodes again, gently wipe the electrodes and let them air dry in the safety hood.To assess the efflux transporter activity of the cells, on day eight of culturing treat the appropriate number of wells with a 10 micromolar efflux transporter inhibitor solution and place in an incubator for one hour at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, treat the cells with a 10 micromolar efflux transporter substrate solution for one hour in the incubator. At the end of the incubation, wash each well twice with 500 microliters of DPBS per well before lysing the cells with 500 microliters DPBS supplemented with 5%Triton-X per well.After five minutes, use a microplate reader to measure the fluorescence of the lysed cells at a 485 nanometer excitation and a 530 nanometer emission. For wells not used in the transporter assay, wash the cells twice with DPBS before fixing with 4%paraformaldehyde per cell nuclei quantification. After one day of culture in E6 medium, the cell morphology is similar to that of iPSCs.By day four, the cells are visibly distinct from iPSCs and cover most of the well. Two days of culture in human endothelial serum-free medium induces an elongated and cobblestone appearance in the cells. At day eight, individual cells form a mostly large cobblestone pattern.A sprouting assay can be performed to demonstrate the angiogenic potential of iPSC-derived BMECs. This leads to the development of tube-like structures after three days of growth factor treatment. The iPSC-derived BMECs generated using this protocol co-expressed tight junction proteins expressed in endothelial cells in the brain, lung, liver, and kidney, as well as vascular endothelial markers expressed at the blood brain barrier.As observed, 48 hours after subculture and medium change iPSC-derived BMECs demonstrate TEER values within the range described for iPSC-derived BMECs that were co-cultured with rat primary astrocytes. Efflux transporter activity was also observed at this stage. After cryopreservation, TEER measurements are lower compared to freshly derived BMECs.Western blot analysis reveals reduced levels of tight junction markers, such as occludin, while immunocytochemistry shows freckled and or frayed patterns of tight junction proteins. A too high or too low iPSC density will affect the differentiation efficiency and impact the development of appropriate blood brain barrier properties. This method enables the investigation of barrier properties cellular signaling and transporter activity using individualized BMECs to model the physiology and pathophysiology of the blood-brain barrier function.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

وهناك طريقة توسيع المركب-ينطبق على مجاميع من العصبية الجذعية البشرية والخلايا المشتقة من الخلايا السلف الجذعية المحفزة أو الجنين أنسجة المخ

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...