Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (to R.K.), een National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). een National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (to R.K.), a Sydney R Baer Jr Foundation Grant (to P.L.) the Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (to R.K.), the Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (to R.K.), the Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (naar R.K.), het Harvard Stem Cell Institute (naar R.K.) en door Steve Willis en Elissa Freud (naar R.K.). We danken Dr. Annie Kathuria voor haar kritische lezing en feedback op het manuscript.

Menselijke iPSC 's werden geherprogrammeerd vanuit de fibroblasten van gezonde donoren met behulp van een protocol dat werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van het Massachusetts General Hospital en McLean Hospital, en werd gekenmerkt zoals beschreven in eerdere studies44,45,46.
OPMERKING: Kortom, fibroblasten werden geherprogrammeerd naar iPSC via mRNA-gebaseerde genetische herprogramm...

Wijzigingen en probleemoplossing
In dit protocol hebben we enkele wijzigingen aangebracht in het gebruik van een veelgebruikte extracellulaire matrix en celkweekmedia tijdens iPSC-culturing voor afleiding van BMECs (figuur 1). Deze wijzigingen hadden geen invloed op het vermogen om BMECS af te leiden van menselijke iPSC 's zoals beschreven in het Lippmann-protocol1. Een iPSC-lijn van een andere gezonde donor werd gebruikt o...

Bloed-hersenbarrièrefunctie De bloed-hersenbarrière (BBB) vormt een grens die de beweging van stoffen van het bloed naar de hersenen beperkt. De BBB bestaat uit microvasculaire endotheelcellen (BMECs) die een monolaag vormen langs de vasculatuur. BMECs vormen samen met astrocyten, neuronen, pericyten, microglia en extracellulaire matrix de neurovasculaire eenheid. BMECs hebben een strak gereguleerde paracellulaire structuur die de BBB in staat stelt een hoge trans-endotheel elektrische weerstand (TEER) te handhaven, die passieve diffusie beperkt en dient als indicator voor barrière-integriteit1,2. BMECs hebben ook eiwitten die helpen bij transcellulaire beweging zoals endocytose, transcytose en transmigratie, evenals extravasatie van leukocyten tijdens een immuunrespons3. BMECs vertrouwen op influx en efflux transporters voor voeding en verwijdering van afvalproducten, om een homeostatische balans in de hersenen te behouden3. Solute Carrier Family 2 member 1 (SLC2A1) is bijvoorbeeld een influx transporter die verantwoordelijk is voor de beweging van glucose over de BBB4, terwijl efflux transporters zoals de ATP binding cassette subfamilie B lid 1 (ABCB1) en de ATP binding cassette subfamilie C lid 1 (ABCC1) verantwoordelijk zijn voor het terugbrengen van substraten terug in de bloedstroom3,5,6,7. ABCB1-substraten omvatten morfine, verapamil4en antipsychotica zoals olanzapine en risperidon8, terwijl de ABCC1-transporteur een verscheidenheid aan substraten heeft, waaronder sulfaatconjugaten, vincristine en glucuronideconjugaten4.
Toepassing van BBB-modellen bij psychiatrische stoornissen BBB-disfunctie is betrokken bij een aantal neurologische en psychiatrische stoornissen, waaronder schizofrenie en bipolairestoornis 9,10. Onlangs werden van iPSC afgeleide ex vivo cellulaire modellen gebruikt om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van psychiatrische stoornissen te ondervragen, maar deze modellen houden momenteel geen rekening met de potentiële rol van de neurovasculatuur11,12,13. Er wordt aangenomen dat perifere inflammatoire cytokinen die in het bloed circuleren een negatieve invloed kunnen hebben op de BBB14,15,16,17, maar er is ook bewijs voor paracellulaire18,19,20,21,22, transcellulaire23,24,25,26,27,28,29, en extracellulaire matrix20,29,30,31,32 afwijkingen die bijdragen aan BBB-disfunctie. Verstoring van de BBB kan ertoe leiden dat de inhoud van het bloed het hersenparenchym binnendringt en astrocyten en/of microglia activeert om pro-inflammatoire cytokinen vrij te geven, die op hun beurt een ontstekingsreactieinitiëren 33 die schadelijke effecten op de hersenen kan hebben34. BMECs zijn de primaire component van de BBB en het onderzoeken van de structuur en functie van deze cellen kan het begrip van BBB-disfunctie bij neurologische en psychiatrische stoornissen verbeteren.
Alternatieve BMEC-modellen Voorafgaand aan de ontwikkeling van efficiënte protocollen voor het afleiden van BMECs uit iPSC's1,6,35,36,hadden onderzoekers vereeuwigde BMECs37 gebruikt om de BBB-functie te bestuderen. Veel van deze modellen slaagden er echter niet in om wenselijke BBB-fenotypen te bereiken, zo'n fysiologisch bereik van TEER-waarden38,39. Het gebruik van iPSC's heeft het voordeel dat de genetische achtergrond van het individu waaruit de cellen zijn afgeleid, behouden blijft. Wetenschappers werken actief aan het opzetten van iPSC-afgeleide ex vivo micromilieumodellen die de structuur en functie van het menselijk brein samenvatten. Onderzoekers hebben methoden ontwikkeld om BMECs af te leiden die structureel en fysiologisch vergelijkbaar zijn met BMECs gevonden in vivo. Methoden voor het verkrijgen van gezuiverde populaties van iPSC-afgeleide BMECs vereisen een aantal verschillende stappen waarbij protocollen in de afgelopen jaren zijn geoptimaliseerd1,6,35,36. Over het algemeen worden iPSC-afgeleide BMECs gedurende 4 dagen gekweekt in Essential 6 (E6) medium, gevolgd door 2 dagen in humaan endotheel serumvrij medium (hESFM) aangevuld met basis fibroblast groeifactor (bFGF), retinoïnezuur (RA) en B27 supplement. De cellen worden vervolgens gekweekt op een collageen IV (COL4) en fibronectine (FN) matrix om >90% homogene BMECs te verkrijgen1.
De identiteit van BMECs wordt bevestigd door immunofluorescentie die de co-expressie van BMEC-eiwitten laat zien, waaronder bloedplaatjes-endotheelcelhechtingsmolecuul-1 (PECAM1), SLC2A1 en strakke verbindingseiwitten zoals tight junction protein 1 (TJP1), occludin (OCLN) en claudin-5 (CLDN5)6. Kiemtests zijn gebruikt om het angiogene potentieel van van iPSC afgeleide BMECs te bevestigen. 6 De BBB-integriteit van BMECs wordt beoordeeld door de aanwezigheid van fysiologische in vitro TEER-waarden (~2000Ω x cm2)37 en meetbare activiteit voor effluxtransporters zoals ABCB1 en ABCC11,6,36. Recente methodologische vooruitgang van de Lippmann-groep heeft geleid tot iPSC-afgeleide BMEC-protocollen met verminderde experimentele variabiliteit en verbeterde reproduceerbaarheid1. Het is echter niet bekend of ze kunnen worden uitgebreid en voorbij het sub-culturing stadium kunnen worden doorgetrokken. Ons gewijzigde protocol is bedoeld om dit probleem aan te pakken door iPSC-afgeleide BMECs na dag 8 door te geven en te beoordelen of ze verder kunnen worden uitgebreid om BBB-eigenschappen te behouden na cryopreservatie. Hoewel er geen studies zijn beschreven over het passeren van iPSC-afgeleide BMECs, bestaat er een protocol voor BMEC cryopreservatie dat fysiologische BBB-eigenschappen behoudt na het ondergaan van een vriesdooicyclus40. Het is echter niet bekend dat BMECs na cryopreservatie kunnen worden doorgegang en BBB-eigenschappen behouden.
BMECs afgeleid van iPSC's die het Lippmann-protocol gebruiken, zijn gebruikt om BBB-verstoring bij neurologische aandoeningen zoals de Ziekte van Huntingtonte modelleren 7. Dergelijke van iPSC afgeleide BMECs zijn ook gebruikt om de effecten van bacteriële infectie zoals Neisseria meningitidis of Groep B Streptococcus op verstoring van de bloed-CSF-barrière en BBB respectievelijk41,42te onderzoeken . Ook, met behulp van iPSC-afgeleide BMECs van 22q deletiesyndroom patiënten met schizofrenie, onderzoekers waargenomen een toename van intercellulaire adhesie molecuul-1 (ICAM-1), een belangrijke adhesie molecuul in BMECs die helpen bij de werving en extravasatie van leukocyten in de hersenen43. Samen tonen deze studies het nut aan van iPSC-afgeleide BMECs voor het bestuderen van BBB-verstoring bij complexe neuropsychiatrische aandoeningen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMECs) kunnen worden onderscheiden van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) om ex vivo cellulaire modellen te ontwikkelen voor het bestuderen van de bloed-hersenbarrière (BBB) functie. Dit gewijzigde protocol biedt gedetailleerde stappen om BMECs af te leiden, uit te breiden en cryopreserve te maken van menselijke iPC's met behulp van een andere donor en reagentia dan die in eerdere protocollen. iPSC's worden behandeld met essentiële 6 medium gedurende 4 dagen, gevolgd door 2 dagen humaan endotheel serumvrij kweekmedium aangevuld met basis fibroblast groeifactor, retinoïnezuur en B27 supplement. Op dag 6 worden cellen gedurende 2 dagen onderverdeeld in een collageen/fibronectinematrix. Immunocytochemie wordt uitgevoerd op dag 8 voor BMEC-markeranalyse met behulp van CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 en SLC2A1. Western blotting wordt uitgevoerd om bmec-markeringsexpressie en afwezigheid van SOX17, een endodermale marker, te bevestigen. Angiogeen potentieel wordt aangetoond met een kiemende test. Trans-endotheel elektrische weerstand (TEER) wordt gemeten met behulp van eetstok elektroden en voltohmmeter vanaf dag 7. Efflux transporter activiteit voor ATP binding cassette onderfamilie B lid 1 en ATP binding cassette onderfamilie C lid 1 wordt gemeten met behulp van een multi-plate reader op dag 8. Succesvolle afleiding van BMECs wordt bevestigd door de aanwezigheid van relevante celmarkers, lage niveaus van SOX17, angiogeen potentieel, transportactiviteit en TEER-waarden ~2000 Ω x cm2. BMECs worden uitgebreid tot dag 10 alvorens over te gaan op vers gecoate collageen/fibronectine platen of cryopreserved. Dit protocol toont aan dat iPSC-afgeleide BMECs ten minste één keer kunnen worden uitgebreid en doorgegeven. Lagere TEER-waarden en een slechtere lokalisatie van BMEC-markers werden echter waargenomen na cryopreservatie. BMECs kunnen worden gebruikt in co-cultuur experimenten met andere celtypen (neuronen, glia, pericyten), in driedimensionale hersenmodellen (organ-chip en hydrogel), voor vascularisatie van hersenorganoïden, en voor het bestuderen van BBB-disfunctie bij neuropsychiatrische aandoeningen.

BMEC Differentiatie Een paar kritieke stappen in dit protocol moeten nauwkeurig worden gevolgd (figuur 1). E6 gemiddeld gebruik op dag 1 is belangrijk, omdat het vaak wordt gebruikt voor het afleiden van neuro-ecomderm-afstamming van iPSC's binnen een relatief korte periode die reproduceerbare resultaten oplevert over meerdere cellijnen36. Een andere belangrijke stap is op dag 4 van differentiatie, waarbij E6 medium moet worden overgeschakeld op hE...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dit protocol beschrijft een aangepaste methode om microvasculaire endotheelcellen van de hersenen af te leiden, uit te breiden en cryopreserveren, verkregen door het differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en om de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière in een ex vivo model te bestuderen.

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

BMECs generated from iPSC provide new experimental models for studying blood brain barrier function and dysfunction. We have used this protocol to examine whether BMECs retain their barrier properties after expansion and cryopreservation. This technique enables the generation of disease-specific BMECs from patients with disorders in which blood-brain barrier disruption plays a role in the pathophysiology of disease.To induce BMEC differentiation from human iPSCs, wash the confluent iPSC culture with DPBS one time before incubating the cells with the appropriate volume of enzymatic EDTA for approximately five minutes at 37 degrees Celsius. When a single cell suspension has been obtained collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in an appropriate volume of stem cell medium supplemented with 10 micromolar ROCK inhibitor for counting. Dilute the cells to 1.56 times 10 to the fourth cells per cubic centimeter concentration and seed two milliliters of cells into individual wells of a six-well flat bottom.After 24 hours in the cell culture incubator replace the supernatant in each well with E6 medium and return the plate to the incubator for four more days. To purify the iPSC-derived BMECs, coat the subculturing plates with the appropriate volume of a freshly prepared collagen IV and fibronectin solution per well and incubate the plates for a minimum of two hours at 37 degrees Celsius. On day six of differentiation collect the cells by centrifugation and resuspend the pellets in the appropriate volume of fresh human endothelial serum-free medium supplemented with B27, basic fibroblasts growth factor, and retinoic acid.For TEER analysis, plate the differentiated cells into each well of a collagen and fibronectin coated 12-transwell filtered plate. For efflux transporter activity analysis, plate the cells into each well of a collagen and fibronectin coated 24-well flat bottom plate. After 24 hours of subculture, replace the supernatant in each well with fresh human endothelial serum-free medium supplemented only with B27 supplement.To measure the blood brain barrier properties of the BMECs using TEER, charge the TEER instrument overnight and lightly wipe the instrument and chopstick electrodes with 70%ethanol before placing them into the safety hood. Switch on the power and calibrate the ohm meter according to the manufacturer's specifications. Plug in the electrodes and rinse them one time with 70%ethanol and one time with DPBS.Place the shorter end of the electrode into the atypical chamber of the insert and the longer end into the basolateral chamber of a blank well. After measuring the negative control response, quickly rinse the electrodes as demonstrated and measure the first experimental well. After all of the measurements have been recorded rinse chopstick electrodes again, gently wipe the electrodes and let them air dry in the safety hood.To assess the efflux transporter activity of the cells, on day eight of culturing treat the appropriate number of wells with a 10 micromolar efflux transporter inhibitor solution and place in an incubator for one hour at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, treat the cells with a 10 micromolar efflux transporter substrate solution for one hour in the incubator. At the end of the incubation, wash each well twice with 500 microliters of DPBS per well before lysing the cells with 500 microliters DPBS supplemented with 5%Triton-X per well.After five minutes, use a microplate reader to measure the fluorescence of the lysed cells at a 485 nanometer excitation and a 530 nanometer emission. For wells not used in the transporter assay, wash the cells twice with DPBS before fixing with 4%paraformaldehyde per cell nuclei quantification. After one day of culture in E6 medium, the cell morphology is similar to that of iPSCs.By day four, the cells are visibly distinct from iPSCs and cover most of the well. Two days of culture in human endothelial serum-free medium induces an elongated and cobblestone appearance in the cells. At day eight, individual cells form a mostly large cobblestone pattern.A sprouting assay can be performed to demonstrate the angiogenic potential of iPSC-derived BMECs. This leads to the development of tube-like structures after three days of growth factor treatment. The iPSC-derived BMECs generated using this protocol co-expressed tight junction proteins expressed in endothelial cells in the brain, lung, liver, and kidney, as well as vascular endothelial markers expressed at the blood brain barrier.As observed, 48 hours after subculture and medium change iPSC-derived BMECs demonstrate TEER values within the range described for iPSC-derived BMECs that were co-cultured with rat primary astrocytes. Efflux transporter activity was also observed at this stage. After cryopreservation, TEER measurements are lower compared to freshly derived BMECs.Western blot analysis reveals reduced levels of tight junction markers, such as occludin, while immunocytochemistry shows freckled and or frayed patterns of tight junction proteins. A too high or too low iPSC density will affect the differentiation efficiency and impact the development of appropriate blood brain barrier properties. This method enables the investigation of barrier properties cellular signaling and transporter activity using individualized BMECs to model the physiology and pathophysiology of the blood-brain barrier function.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...