Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Ces travaux ont été appuyés par un Prix national de recherche biocomportemental de l’Institut national de santé mentale pour les nouveaux scientifiques innovateurs (BRAINS) Prix R01MH113858 (à R.K.), un National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). un National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (à R.K.), une subvention de la Sydney R Baer Jr Foundation Grant (à P.L.) le Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (à R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (à R.K.), le Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (à R.K.), le Harvard Stem Cell Institute (à R.K.) et par Steve Willis et Elissa Freud (à R.K.). Nous remercions la Dre Annie Kathuria pour sa lecture critique et ses commentaires sur le manuscrit.

Les iPSCs humains ont été reprogrammés à partir des fibroblastes de donneurs en bonne santé à l’aide d’un protocole approuvé par les commissions d’examen institutionnel du Massachusetts General Hospital et de l’Hôpital McLean, et caractérisé comme décrit dans des étudesantérieures 44,45,46.
REMARQUE : En bref, les fibroblastes ont été reprogrammés à l’iPSC par reprogrammatio...

Modifications et dépannage
Dans ce protocole, nous avons apporté quelques modifications à l’utilisation d’une matrice extracellulaire couramment utilisée et de médias de culture cellulaire pendant la culture iPSC pour la dérivation des BMECs (Figure 1). Ces changements n’ont pas eu d’impact sur la capacité de tirer BMECS des iPSCs humains tels que décrits dans le protocole Lippmann1. Une lignée iPSC d’un ...

Fonction barrière céphalo-cérébrale La barrière céphalo-encéphalique (BBB) forme une limite qui limite le mouvement des substances du sang vers le cerveau. Le BBB est composé de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMECs) qui forment un monocouche tapissant la vascularisation. Les BMEC, ainsi que les astrocytes, les neurones, les péricytes, les microglies et la matrice extracellulaire, forment l’unité neurovasculaire. Les BMEC ont une structure paracellulaire étroitement régulée qui permet au BBB de maintenir une résistance électrique trans-endothéliale élevée (TEER), ce qui limite la diffusion passive et sert d’indicateur del’intégrité de la barrière 1,2. Les BMEC ont également des protéines qui aident au mouvement transcellulaire tel que l’endocytose, la transcytose, et la transmigration, aussi bien que l’extravasation des leucocytes pendant une réponse immunisée3. Les BMEC comptent sur l’afflux et les transporteurs d’efflux pour nourrir et enlever les déchets, afin de maintenir un équilibre homéostatique dans lecerveau 3. Par exemple, solute transporteur famille 2 membre 1 (SLC2A1) est un transporteur d’afflux responsable du mouvement du glucose à travers le BBB4, tandis que les transporteurs efflux tels que la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 (ABCB1) et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 (ABCC1) sont responsables du retour des substrats dans le fluxsanguin 3,5,6,7. Les substrats ABCB1 comprennent la morphine, le verapamil4et les antipsychotiques tels que l’olanzapine et la rispéridone8,tandis que le transporteur ABCC1 a une variété de substrats, y compris les conjugués de sulfate, la vincristine et les conjugués au glucuronide4.
Application de modèles BBB dans les troubles psychiatriques Le dysfonctionnement de BBB a été impliqué dans un certain nombre de désordres neurologiques et psychiatriques, y compris la schizophrénie et le désordrebipolaire 9,10. Récemment, des modèles cellulaires ex vivo dérivés de l’iPSC sont utilisés pour interroger les fondements cellulaires et moléculaires des troubles psychiatriques, mais ces modèles ne prennent actuellement pas en compte le rôle potentiel joué par la neurovasculature11,12,13. On émet l’hypothèse que les cytokines inflammatoires périphériques circulant dans le sang peuvent avoir un impact négatif sur le BBB14,15,16,17, mais il ya aussi des preuves pour paracellulaire18,19,20,21,22, transcellulaire23,24,25,26,27,28,29,et la matrice extracellulaire20,29,30,31,32 anomalies contribuant au dysfonctionnement BBB. La perturbation du BBB peut avoir comme conséquence le contenu du sang entrant dans le parenchyme de cerveau et activant des astrocytes et/ou des microglies pour libérer des cytokines proinflammatory, qui à leur tour initient une réponseinflammatoire 33 qui peut avoir des effets préjudiciables surle cerveau 34. Les BMEC sont la composante principale du BBB et l’examen de la structure et de la fonction de ces cellules peut améliorer la compréhension du dysfonctionnement de BBB dans les désordres neurologiques et psychiatriques.
Modèles alternatifs BMEC Avant l’élaboration de protocoles efficaces pour l’exploitation des BMECs à partir d’iPSC1,6,35,36, les chercheurs avaient utilisé des BMECsimmortalisés 37 pour étudier la fonction BBB. Cependant, beaucoup de ces modèles n’ont pas atteint les phénotypes souhaitables de BBB, une telle gamme physiologique des valeurs de TEER38,39. L’utilisation d’iPSCs a l’avantage de conserver le contexte génétique de l’individu à partir duquel les cellules sont dérivées. Les scientifiques travaillent activement à l’établissement de modèles de microenvironnement ex vivo dérivés de l’iPSC qui récapitulent la structure et la fonction du cerveau humain. Les chercheurs ont mis au point des méthodes pour obtenir des BMEC qui sont structurellement et physiologiquement similaires aux BMECs trouvés in vivo. Les méthodes d’obtention de populations purifiées de BMEC dérivés de l’iPSC nécessitent un certain nombre d’étapes différentes avec des protocoles optimisés au cours desdernières années 1,6,35,36. Généralement, les BMECs iPSC-dérivés sont cultivés dans le milieu essentiel 6 (E6) pendant 4 jours, suivis de 2 jours dans le milieu sans sérum endothélial humain (hESFM) complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base (bFGF), l’acide rétinoïque (RA), et le supplément de B27. Les cellules sont ensuite cultivés sur une matrice de collagène IV (COL4) et de fibronectine (FN) pour obtenir >90% homogène BMECs1.
L’identité des BMEC est confirmée par immunofluorescence montrant la co-expression des protéines BMEC, y compris la molécule d’adhérence des cellules plaquettaire-endothéliales-1 (PECAM1), SLC2A1, et les protéines de jonction serrées telles que la protéine de jonction serrée 1 (TJP1), l’occludine (OCLN) et la claudin-5 (CLDN5)6. Des analyses de germination ont été employées pour confirmer le potentiel angiogenic des BMECs iPSC-dérivés. 6 L’intégrité BBB des BMEC est évaluée par la présence de valeurs physiologiques in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 et d’activité mesurable pour les transporteurs d’efflux tels que ABCB1 et ABCC11,6,36. Les progrès méthodologiques récents du groupe Lippmann ont conduit à des protocoles BMEC dérivés de l’iPSC avec une variabilité expérimentale réduite et une reproductibilitéaccrue 1. Cependant, on ne sait pas s’ils peuvent être étendus et transmis au-delà de l’étape de la sous-culture. Notre protocole modifié vise à résoudre ce problème en réussissant les BMEC dérivés de l’iPSC au-delà du jour 8 et en évaluant s’ils peuvent être encore élargis pour conserver les propriétés BBB après cryopréservation. Bien qu’aucune étude n’ait décrit le passage des BMECs iPSC-dérivés, un protocole existe pour la cryopréservation de BMEC qui retient des propriétés physiologiques de BBB après avoir subi un cycle de gel-dégel40. Cependant, il n’est pas connu après la cryopréservation BMECs peuvent être adoptés et conserver les propriétés BBB.
Les BMECs dérivés d’iPSCs utilisant le protocole Lippmann ont été utilisés pour modéliser la perturbation bbb dans les troubles neurologiques tels que la maladie de Huntington7. Ces BMECs iPSC-dérivés ont également été utilisés pour étudier les effets de l’infection bactérienne telle que Neisseria meningitidis ou Streptococcus de groupe B sur la perturbation de la barrière de sang-CSF et BBBrespectivement 41,42. En outre, utilisant des BMECs iPSC-dérivés des patients de syndrome de suppression de 22q présentant la schizophrénie, les chercheurs ont observé une augmentation de molécule d’adhérence intercellulaire-1 (ICAM-1), une molécule importante d’adhérence dans les BMECs qui aident au recrutement et à l’extravasation des leucocytes dans lecerveau 43. Prises ensemble, ces études démontrent l’utilité des BMECs iPSC-dérivés pour étudier la perturbation de BBB dans les désordres neuropsychiatriques complexes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (BMECs) peuvent être différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (IPSC) pour développer des modèles cellulaires ex vivo pour étudier la fonction de barrière céphalo-encéphalique (BBB). Ce protocole modifié fournit des étapes détaillées pour tirer, étendre et cryopréserver les CPE des IPSC humains à l’aide d’un donneur et d’un reagents différents de ceux rapportés dans les protocoles précédents. Les iPSC sont traités avec le milieu essentiel de 6 pendant 4 jours, suivis de 2 jours de milieu humain endothélial de culture sérum-libre complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base, l’acide rétinoïque, et le supplément de B27. Au jour 6, les cellules sont sous-cultivés sur une matrice collagène/fibronectine pendant 2 jours. L’immunocytochimie est effectuée au jour 8 pour l’analyse des marqueurs BMEC à l’aide de CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 et SLC2A1. Le ballonnement occidental est exécuté pour confirmer l’expression de marqueur de BMEC, et l’absence de SOX17, un marqueur endodermal. Le potentiel angiogénique est démontré avec un essai de germination. La résistance électrique trans-endothéliale (TEER) est mesurée à l’aide d’électrodes baguettes et de voltohmmètres à partir du jour 7. L’activité transporteur Efflux pour la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 est mesurée à l’aide d’un lecteur multi-plaques au jour 8. La dérivation réussie des BMEC est confirmée par la présence de marqueurs cellulaires pertinents, de faibles niveaux de SOX17, de potentiel angiogénique, d’activité de transporteur et de valeurs TEER ~2000 Ω x cm2. Les BMEC sont élargis jusqu’au jour 10 avant de passer sur des plaques de collagène/fibronectine fraîchement enrobées ou cryopréservées. Ce protocole démontre que les BMEC dérivés de l’iPSC peuvent être élargis et adoptés au moins une fois. Cependant, des valeurs TEER plus faibles et une localisation plus faible des marqueurs BMEC ont été observées après cryopréservation. Les BMEC peuvent être utilisés dans des expériences de co-culture avec d’autres types de cellules (neurones, gliales, péricytes),dans des modèles cérébraux tridimensionnels (puce d’organe et hydrogel), pour la vascularisation des organoïdes cérébraux, et pour étudier le dysfonctionnement de BBB dans les désordres neuropsychiatriques.

Différenciation BMEC Quelques étapes critiques de ce protocole doivent être suivies avec précision (Figure 1). E6 utilisation moyenne le jour 1 est important, car il est souvent utilisé pour dériver la lignée neuroectoderm des iPSC dans un délai relativement court donnant des résultats reproductibles à travers plusieurs lignéescellulaires 36. Une autre étape importante est le jour 4 de la différenciation, où e6 moyen devrait être com...

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Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Ce protocole détaille une méthode adaptée pour dériver, étendre, et cryopréserver des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau obtenues en différeciant les cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et pour étudier des propriétés de barrière de cerveau de sang dans un modèle ex vivo.

Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

BMECs generated from iPSC provide new experimental models for studying blood brain barrier function and dysfunction. We have used this protocol to examine whether BMECs retain their barrier properties after expansion and cryopreservation. This technique enables the generation of disease-specific BMECs from patients with disorders in which blood-brain barrier disruption plays a role in the pathophysiology of disease.To induce BMEC differentiation from human iPSCs, wash the confluent iPSC culture with DPBS one time before incubating the cells with the appropriate volume of enzymatic EDTA for approximately five minutes at 37 degrees Celsius. When a single cell suspension has been obtained collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in an appropriate volume of stem cell medium supplemented with 10 micromolar ROCK inhibitor for counting. Dilute the cells to 1.56 times 10 to the fourth cells per cubic centimeter concentration and seed two milliliters of cells into individual wells of a six-well flat bottom.After 24 hours in the cell culture incubator replace the supernatant in each well with E6 medium and return the plate to the incubator for four more days. To purify the iPSC-derived BMECs, coat the subculturing plates with the appropriate volume of a freshly prepared collagen IV and fibronectin solution per well and incubate the plates for a minimum of two hours at 37 degrees Celsius. On day six of differentiation collect the cells by centrifugation and resuspend the pellets in the appropriate volume of fresh human endothelial serum-free medium supplemented with B27, basic fibroblasts growth factor, and retinoic acid.For TEER analysis, plate the differentiated cells into each well of a collagen and fibronectin coated 12-transwell filtered plate. For efflux transporter activity analysis, plate the cells into each well of a collagen and fibronectin coated 24-well flat bottom plate. After 24 hours of subculture, replace the supernatant in each well with fresh human endothelial serum-free medium supplemented only with B27 supplement.To measure the blood brain barrier properties of the BMECs using TEER, charge the TEER instrument overnight and lightly wipe the instrument and chopstick electrodes with 70%ethanol before placing them into the safety hood. Switch on the power and calibrate the ohm meter according to the manufacturer's specifications. Plug in the electrodes and rinse them one time with 70%ethanol and one time with DPBS.Place the shorter end of the electrode into the atypical chamber of the insert and the longer end into the basolateral chamber of a blank well. After measuring the negative control response, quickly rinse the electrodes as demonstrated and measure the first experimental well. After all of the measurements have been recorded rinse chopstick electrodes again, gently wipe the electrodes and let them air dry in the safety hood.To assess the efflux transporter activity of the cells, on day eight of culturing treat the appropriate number of wells with a 10 micromolar efflux transporter inhibitor solution and place in an incubator for one hour at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, treat the cells with a 10 micromolar efflux transporter substrate solution for one hour in the incubator. At the end of the incubation, wash each well twice with 500 microliters of DPBS per well before lysing the cells with 500 microliters DPBS supplemented with 5%Triton-X per well.After five minutes, use a microplate reader to measure the fluorescence of the lysed cells at a 485 nanometer excitation and a 530 nanometer emission. For wells not used in the transporter assay, wash the cells twice with DPBS before fixing with 4%paraformaldehyde per cell nuclei quantification. After one day of culture in E6 medium, the cell morphology is similar to that of iPSCs.By day four, the cells are visibly distinct from iPSCs and cover most of the well. Two days of culture in human endothelial serum-free medium induces an elongated and cobblestone appearance in the cells. At day eight, individual cells form a mostly large cobblestone pattern.A sprouting assay can be performed to demonstrate the angiogenic potential of iPSC-derived BMECs. This leads to the development of tube-like structures after three days of growth factor treatment. The iPSC-derived BMECs generated using this protocol co-expressed tight junction proteins expressed in endothelial cells in the brain, lung, liver, and kidney, as well as vascular endothelial markers expressed at the blood brain barrier.As observed, 48 hours after subculture and medium change iPSC-derived BMECs demonstrate TEER values within the range described for iPSC-derived BMECs that were co-cultured with rat primary astrocytes. Efflux transporter activity was also observed at this stage. After cryopreservation, TEER measurements are lower compared to freshly derived BMECs.Western blot analysis reveals reduced levels of tight junction markers, such as occludin, while immunocytochemistry shows freckled and or frayed patterns of tight junction proteins. A too high or too low iPSC density will affect the differentiation efficiency and impact the development of appropriate blood brain barrier properties. This method enables the investigation of barrier properties cellular signaling and transporter activity using individualized BMECs to model the physiology and pathophysiology of the blood-brain barrier function.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recherche

Neurosciences

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurone-oligodendrocytes

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...