Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש Biobehavioral פרסי מחקר למדענים חדשים חדשניים (BRAINS) פרס R01MH113858 (כדי R.K.), המכון הלאומי לבריאות פרס KL2 TR002542 (PL). פרס המכון הלאומי לפיתוח מדענים קליניים של המכון לבריאות הנפש K08MH086846 (ל-R.K.), מענק קרן סידני R בר ג'וניור (לפי.אל) פרס פיתוח המדען הקליני של קרן הצדקה דוריס דיוק (ל-R.K.), קרן ריאן ליכט סאנג דו-קוטבית (ל-R.K.), פיליס & קרן ג'רום לייל רפפורט (ל אר.קיי), מכון תאי הגזע של הרווארד (ל-R.K. ) ועל ידי סטיב ויליס ואליסה פרויד (ל אר.קיי). אנו מודים לד"ר אנני קת'וריה על הקריאה הביקורתית והמשוב על כתב היד.

IPSCs אנושיים תכנתו מחדש מן fibroblasts של תורמים בריאים באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדות לבדיקה מוסדית של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס ומקלין החולים, ואפיינו כמתואר במחקריםקודמים 44,45,46.
הערה: בקצרה, פיברובלסטים תוכנתו מחדש ל-...

שינויים ופתרון בעיות
בפרוטוקול זה, ביצענו כמה שינויים בשימוש במטריצה חוץ-תאית נפוצה ובמדיה של תרבות תאים במהלך פולחן iPSC להפקת BMECs (איור 1). שינויים אלה לא השפיעו על היכולת להפיק BMECS מ- IPSCs אנושי כמתואר בפרוטוקול ליפמן1. קו iPSC מתורם בריא אחר...

תפקוד מחסום הדם - מוח מחסום הדם - מוח (BBB) יוצר גבול המגביל את תנועת החומרים מהדם למוח. ה- BBB מורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMECs) היוצרים מונולאייה המצפים את כלי הדם. BMECs, יחד עם אסטרוציטים, נוירונים, pericytes, microglia, ומטריצה חוץ תאית, יוצרים את היחידה neurovascular. BMECs יש מבנה paracellular מוסדר היטב המאפשר BBB לשמור על התנגדות חשמלית טרנס אנדותל גבוהה (TEER), אשר מגביל דיפוזיה פסיבית ומשמש כאינדיקטור של שלמות מחסום1,2. BMECs יש גם חלבונים המסייעים עם תנועה transcellular כגון אנדוציטוזיס, transcytosis, גלגול, כמו גם פזרנות של לויקוציטים במהלך תגובה חיסונית3. BMECs מסתמכים על מובילי זרם ופלוטות להזנה והסרה של מוצרי פסולת, על מנת לשמור על איזון הומאוסטטי במוח3. לדוגמה, משפחת נשאים מסיסים 2 חבר 1 (SLC2A1) הוא טרנספורטר זרם אחראי על התנועה של גלוקוז על פני BBB4, בעוד מובילי efflux כגון קלטת מחייבת ATP subfamily B חבר 1 (ABCB1) ואת קלטת איגוד ATP subfamily C חבר 1 (ABCC1) אחראים להחזרת מצעים בחזרה לזרם הדם3,5, 6,7. עם המצעים של ABCB1 נמנים מורפיום, וראפמיל4ואנטי-פסיכוטיים כגון אולנזאפין וריספרידון8, ואילו במשגר ABCC1 יש מגוון מצעים, כולל צירופי סולפט, וינקריסטין וגלוקורוניד4.
יישום מודלים BBB בהפרעות פסיכיאטריות תפקוד לקוי של BBB היה מעורב במספר הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, כולל סכיזופרניה והפרעה דוקוטבית 9,10. לאחרונה, מודלים תאיים אקס ויוו שמקורם ב- iPSC מנוצלים כדי לחקור את היסודות התאיים והמולקולריים של הפרעות פסיכיאטריות, אך מודלים אלה אינם לוקחים בחשבון את התפקיד הפוטנציאלי שמילא המוח11,12,13. השערה היא כי ציטוקינים דלקתיים היקפיים במחזור הדם יכולים להשפיע לרעה על BBB14,15,16,17, אבל יש גם ראיות paracellular18,19,20,21,2 2, טרנסצ'לרי23,24,25,26,27,28,29, ומטריצה חוץ תאית20,29,30,31,32 ליקויים התורמים לתפקוד לקוי של BBB. הפרעה של BBB יכול לגרום לתוכן הדם נכנס parenchyma המוח והפעלת אסטרוציטים ו / או microglia לשחרר ציטוקינים proinflammatory, אשר בתורו ליזום תגובה דלקתית33 זה יכול להיות השפעות מזיקות על המוח34. BMECs הם המרכיב העיקרי של BBB ובחינת המבנה והתפקוד של תאים אלה יכול לשפר את ההבנה של תפקוד לקוי BBB בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות.
מודלים חלופיים של BMEC לפני הפיתוח של פרוטוקולים יעילים להפקת BMECs מ IPSCs1,6,35,36, חוקרים השתמשו BMECs מונצח37 ללמוד פונקציה BBB. עם זאת, רבים מהמודלים הללו לא הצליחו להשיג פנוטיפים רצויים של BBB, טווח פיזיולוגי כזה של ערכי TEER38,39. ניצול iPSCs יש את היתרון של שמירה על הרקע הגנטי של הפרט שממנו נגזרים התאים. מדענים עובדים באופן פעיל על הקמת מודלים ex vivo microenvironment שמקורם ב- iPSC, המאכלסים מחדש את המבנה והתפקוד של המוח האנושי. חוקרים פיתחו שיטות להפקת BMECs הדומים מבחינה מבנית ופיזיולוגית ל- BMECs שנמצאו ב vivo. שיטות להשגת אוכלוסיות מטוהרות של BMECs הנגזרים מ- iPSC דורשות מספר שלבים שונים עם אופטימיזציה של פרוטוקולים בשנים האחרונות1,6,35,36. בדרך כלל, BMECs נגזר iPSC מתורבת חיוני 6 (E6) בינוני במשך 4 ימים, ואחריו 2 ימים בינוני ללא סרום אנדותל אנושי (hESFM) בתוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF), חומצה רטינואית (RA), ותוסף B27. לאחר מכן התאים מתרבתים על קולגן IV (COL4) ומטריצת פיברונקטין (FN) כדי להשיג >90% BMECsהומוגניים 1.
זהותם של BMECs מאושרת על ידי immunofluorescence המציג את הביטוי המשותף של חלבוני BMEC כולל מולקולת הידבקות תאי טסיות דם-אנדותל-1 (PECAM1), SLC2A1 וחלבוני צומת הדוקים כגון חלבון צומת הדוק 1 (TJP1), occludin (OCLN) וקלודין-5 (CLDN5)6. מבחנים נבטים שימשו כדי לאשר את הפוטנציאל האנגיוגני של BMECs שמקורם ב- iPSC. 6 שלמות BBB של BMECs מוערכת על ידי נוכחות של ערכי TEER במבחנה פיזיולוגיים (~ 2000Ω x ס"מ2)37 ופעילות מדידה עבור מובילי קולוקס כגון ABCB1 ו- ABCC11,6,36. ההתקדמות המתודולוגית האחרונה של קבוצת ליפמן הובילה לפרוטוקולי BMEC הנגזרים מ- iPSC עם שונות ניסיונית מופחתת ושחזור משופר1. עם זאת, לא ידוע אם ניתן להרחיבם ולעבור מעבר לשלב התת-פולחן. הפרוטוקול שלנו שונה שואפת לטפל בבעיה זו על ידי העברת BMECs נגזר iPSC מעבר ליום 8 ולהעריך אם הם יכולים להיות מורחבים עוד יותר כדי לשמור על נכסי BBB לאחר cryopreservation. אמנם אין מחקרים תיארו פסיעה של BMECs שמקורם ב- iPSC, אך קיים פרוטוקול עבור cryopreservation BMEC ששומר על תכונות BBB פיזיולוגיות לאחר שעבר מחזור הפשרה בהקפאה40. עם זאת, זה לא ידוע לאחר cryopreservation BMECs ניתן להעביר ולשמור על מאפייני BBB.
BMECs נגזר iPSCs באמצעות פרוטוקול ליפמן נוצלו כדי מודל הפרעה BBB בהפרעות נוירולוגיות כגון מחלת הנטינגטון7. BMECs אלה שמקורם ב- iPSC שימשו גם כדי לחקור את ההשפעות של זיהום חיידקי כגון מנינגיטידיס Neisseria או סטרפטוקוקוס קבוצה B על שיבוש מחסום CSF בדם ו- BBB בהתאמה41,42. כמו כן, באמצעות BMECs שמקורם ב- iPSC מתסמונת מחיקה של 22q חולים עם סכיזופרניה, החוקרים הבחינו בעלייה במולקולת הידבקות בין תאית-1 (ICAM-1), מולקולת הידבקות גדולה ב- BMECs המסייעת בגיוס ופזרנות של לויקוציטים למוח43. יחד, מחקרים אלה מדגימים את התועלת של BMECs נגזר iPSC לחקר שיבוש BBB בהפרעות נוירופסיכיאטריות מורכבות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMECs) ניתנים להבחנה מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (iPSCs) כדי לפתח מודלים תאיים אקס ויוו לחקר תפקוד מחסום הדם - מוח (BBB). פרוטוקול זה שהשתנה מספק שלבים מפורטים להפקה, הרחבה והקפאה של בקרי BME מ- IPSCs אנושיים באמצעות תורם ריאגנטים שונים מאלה שדווחו בפרוטוקולים קודמים. iPSCs מטופלים עם חיוני 6 בינוני במשך 4 ימים, ואחריו 2 ימים של מדיום תרבות ללא סרום אנדותל אנושי בתוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי, חומצה רטינואית, ותוסף B27. ביום 6, תאים הם תת תרבית על מטריצה קולגן / פיברונקטין במשך 2 ימים. אימונוציטוכימיה מבוצעת ביום 8 לניתוח סמן BMEC באמצעות CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 ו- SLC2A1. סופג מערבי מבוצע כדי לאשר ביטוי סמן BMEC, והיעדר SOX17, סמן אנדודרמלי. פוטנציאל אנגיוגני מודגם עם מבחני נבטים. התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TEER) נמדדת באמצעות אלקטרודות מקלות אכילה ו voltohmmeter החל מהיום 7. פעילות טרנספורטר Efflux עבור קלטת איגוד ATP subfamily B חבר 1 ו ATP כיסוי קלטת subfamily C חבר 1 נמדד באמצעות קורא מרובה לוחות ביום 8. נגזרת מוצלחת של BMECs מאושרת על ידי נוכחות של סמני תא רלוונטיים, רמות נמוכות של SOX17, פוטנציאל אנגיוגני, פעילות טרנספורטר וערכי TEER ~ 2000 Ω x ס"מ2. BMECs מורחבים עד היום 10 לפני המעבר על לוחות קולגן / פיברונקטין מצופים טריים או cryopreserved. פרוטוקול זה מדגים שניתן להרחיב ולעבור בין בקרי BME הנגזרים מ- iPSC לפחות פעם אחת. עם זאת, ערכי TEER נמוכים יותר ולוקליזציה ירודה יותר של סמני BMEC נצפו לאחר ההקפאה. BMECs יכול להיות מנוצל בניסויים תרבית משותפת עם סוגי תאים אחרים (נוירונים, גליה, pericytes), במודלים תלת מימדיים במוח (איבר שבב הידרוג'ל), עבור כלי דם של אורגנואידים במוח, ועל לימוד תפקוד לקוי BBB בהפרעות נוירופסיכיאטריות.

בידול BMEC יש לבצע במדויק כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה (איור 1). E6 שימוש בינוני ביום 1 חשוב, שכן הוא משמש לעתים קרובות להפקת שושלת נוירוקטודרם מ iPSCs בתוך פרק זמן קצר יחסית של זמן מניב תוצאות לשחזור על פני שורות תאים מרובים36. צעד חשוב נוסף הוא ביום 4 של בי?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

פרוטוקול זה מפרט שיטה מותאמת להפקה, הרחבה והקפאה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המתקבלים על ידי הבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם, ולחקור תכונות מחסום מוח בדם במודל אקס ויוו.

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

BMECs generated from iPSC provide new experimental models for studying blood brain barrier function and dysfunction. We have used this protocol to examine whether BMECs retain their barrier properties after expansion and cryopreservation. This technique enables the generation of disease-specific BMECs from patients with disorders in which blood-brain barrier disruption plays a role in the pathophysiology of disease.To induce BMEC differentiation from human iPSCs, wash the confluent iPSC culture with DPBS one time before incubating the cells with the appropriate volume of enzymatic EDTA for approximately five minutes at 37 degrees Celsius. When a single cell suspension has been obtained collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in an appropriate volume of stem cell medium supplemented with 10 micromolar ROCK inhibitor for counting. Dilute the cells to 1.56 times 10 to the fourth cells per cubic centimeter concentration and seed two milliliters of cells into individual wells of a six-well flat bottom.After 24 hours in the cell culture incubator replace the supernatant in each well with E6 medium and return the plate to the incubator for four more days. To purify the iPSC-derived BMECs, coat the subculturing plates with the appropriate volume of a freshly prepared collagen IV and fibronectin solution per well and incubate the plates for a minimum of two hours at 37 degrees Celsius. On day six of differentiation collect the cells by centrifugation and resuspend the pellets in the appropriate volume of fresh human endothelial serum-free medium supplemented with B27, basic fibroblasts growth factor, and retinoic acid.For TEER analysis, plate the differentiated cells into each well of a collagen and fibronectin coated 12-transwell filtered plate. For efflux transporter activity analysis, plate the cells into each well of a collagen and fibronectin coated 24-well flat bottom plate. After 24 hours of subculture, replace the supernatant in each well with fresh human endothelial serum-free medium supplemented only with B27 supplement.To measure the blood brain barrier properties of the BMECs using TEER, charge the TEER instrument overnight and lightly wipe the instrument and chopstick electrodes with 70%ethanol before placing them into the safety hood. Switch on the power and calibrate the ohm meter according to the manufacturer's specifications. Plug in the electrodes and rinse them one time with 70%ethanol and one time with DPBS.Place the shorter end of the electrode into the atypical chamber of the insert and the longer end into the basolateral chamber of a blank well. After measuring the negative control response, quickly rinse the electrodes as demonstrated and measure the first experimental well. After all of the measurements have been recorded rinse chopstick electrodes again, gently wipe the electrodes and let them air dry in the safety hood.To assess the efflux transporter activity of the cells, on day eight of culturing treat the appropriate number of wells with a 10 micromolar efflux transporter inhibitor solution and place in an incubator for one hour at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, treat the cells with a 10 micromolar efflux transporter substrate solution for one hour in the incubator. At the end of the incubation, wash each well twice with 500 microliters of DPBS per well before lysing the cells with 500 microliters DPBS supplemented with 5%Triton-X per well.After five minutes, use a microplate reader to measure the fluorescence of the lysed cells at a 485 nanometer excitation and a 530 nanometer emission. For wells not used in the transporter assay, wash the cells twice with DPBS before fixing with 4%paraformaldehyde per cell nuclei quantification. After one day of culture in E6 medium, the cell morphology is similar to that of iPSCs.By day four, the cells are visibly distinct from iPSCs and cover most of the well. Two days of culture in human endothelial serum-free medium induces an elongated and cobblestone appearance in the cells. At day eight, individual cells form a mostly large cobblestone pattern.A sprouting assay can be performed to demonstrate the angiogenic potential of iPSC-derived BMECs. This leads to the development of tube-like structures after three days of growth factor treatment. The iPSC-derived BMECs generated using this protocol co-expressed tight junction proteins expressed in endothelial cells in the brain, lung, liver, and kidney, as well as vascular endothelial markers expressed at the blood brain barrier.As observed, 48 hours after subculture and medium change iPSC-derived BMECs demonstrate TEER values within the range described for iPSC-derived BMECs that were co-cultured with rat primary astrocytes. Efflux transporter activity was also observed at this stage. After cryopreservation, TEER measurements are lower compared to freshly derived BMECs.Western blot analysis reveals reduced levels of tight junction markers, such as occludin, while immunocytochemistry shows freckled and or frayed patterns of tight junction proteins. A too high or too low iPSC density will affect the differentiation efficiency and impact the development of appropriate blood brain barrier properties. This method enables the investigation of barrier properties cellular signaling and transporter activity using individualized BMECs to model the physiology and pathophysiology of the blood-brain barrier function.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...