Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da un National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (a R.K.), un National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). un National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (a R.K.), un Sydney R Baer Jr Foundation Grant (a P.L.) il Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), il Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), l'Harvard Stem Cell Institute (a R.K.) e da Steve Willis ed Elissa Freud (a R.K.). Ringraziamo la dott.ssa Annie Kathuria per la sua lettura critica e il feedback sul manoscritto.

Gli iPSC umani sono stati riprogrammati dai fibroblasti di donatori sani utilizzando un protocollo approvato dagli Institutional Review Boards del Massachusetts General Hospital e del McLean Hospital, e caratterizzato come descritto negli studiprecedenti 44,45,46.
NOTA: In breve, i fibroblasti sono stati riprogrammati in iPSC tramite riprogrammazione genetica basata sull'mRNA47...

Modifiche e risoluzione dei problemi
In questo protocollo sono state apportate alcune modifiche all'utilizzo di una matrice extracellulare comunemente utilizzata e di supporti di coltura cellulare durante la coltura iPSC per la derivazione di BMEC (Figura 1). Queste modifiche non hanno influito sulla capacità di ricavare BMECS dagli iPSC umani come descritto nel protocolloLippmann 1. Una linea iPSC di un donatore sano dive...

Funzione barriera ematico-encefalica La barriera eto-encefalica (BBB) forma un confine che limita il movimento delle sostanze dal sangue al cervello. La BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) che formano un monostrato che rivestono la vascolarizzazione. I BMEC, insieme ad astrociti, neuroni, periciti, microglia e matrice extracellulare, formano l'unità neurovascolare. I BMEC hanno una struttura paracellulare strettamente regolata che consente alla BBB di mantenere un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER), che limita la diffusione passiva e funge da indicatore di integritàdella barriera 1,2. I BMEC hanno anche proteine che aiutano con il movimento transcellulare come l'endocitosi, la tracitosi e la trasmigrazione, così come l'estravasazione dei leucociti durante una risposta immunitaria3. I BMEC si affidano ai trasportatori di afflussi ed efflux per il nutrimento e la rimozione dei prodotti di scarto, al fine di mantenere un equilibrio omeostatico nelcervello 3. Ad esempio, solute carrier family 2 membro 1 (SLC2A1) è un trasportatore di afflusso responsabile del movimento del glucosio attraverso il BBB 4 ,mentrei trasportatori efflux come la sottofamiglia di cassette binding ATP B membro 1 (ABCB1) e la sottofamiglia di cassette binding ATP membro C 1 (ABCC1) sono responsabili della restituzione dei substrati nel flussosanguigno 3,5,6,7. I substrati ABCB1 includono morfina, verapamil4e antipsicotici come olanzapina e risperidone8, mentre il trasportatore ABCC1 ha una varietà di substrati tra cui coniugati solfati, vincristina e coniugatiglucuronide 4.
Applicazione di modelli BBB nei disturbi psichiatrici La disfunzione della BBB è stata implicata in una serie di disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui schizofrenia e disturbobipolare 9,10. Recentemente, i modelli cellulari ex vivo derivati da iPSC vengono utilizzati per interrogare le basi cellulari e molecolari dei disturbi psichiatrici, ma questi modelli attualmente non tengono conto del ruolo potenziale svolto dalla neurovascolarizzazione11,12,13. Si ipotizza che le citochine infiammatorie periferiche che circolano nel sangue possano avere un impatto negativo sulla BBB14,15,16,17, ma ci sono anche prove diparacellulare 18,19,20,21, 122, matrice transcellulare23,24,25,26,27,28,29e matrice extracellulare20,29,30,31,32 anomalie che contribuiscono alla disfunzione BBB. L'interruzione della BBB può comportare l'ingresso del contenuto di sangue nel parenchima cerebrale e l'attivazione di astrociti e / o microglia per rilasciare citochine proinfiammatorie, che a loro volta avviano unarisposta infiammatoria 33 che può avere effetti dannosi sulcervello 34. I BMEC sono la componente primaria della BBB e l'esame della struttura e della funzione di queste cellule può migliorare la comprensione della disfunzione BBB nei disturbi neurologici e psichiatrici.
Modelli BMEC alternativi Prima dello sviluppo di protocolli efficienti per la derivazione di BMEC da iPSC1,6,35,36, i ricercatori avevano utilizzato BMECimmortalati 37 per studiare la funzione BBB. Tuttavia, molti di questi modelli non sono riusciti a raggiungere i fenotipi BBB desiderabili, un tale intervallo fisiologico di valori TEER38,39. L'utilizzo degli iPSC ha il vantaggio di mantenere il background genetico dell'individuo da cui derivano le cellule. Gli scienziati stanno lavorando attivamente alla definizione di modelli di microambiente ex vivo derivati da iPSC che ricapitolano la struttura e la funzione del cervello umano. I ricercatori hanno sviluppato metodi per ricavare BMEC strutturalmente e fisiologicamente simili ai BMEC trovati in vivo. I metodi per ottenere popolazioni purificate di BMEC derivati da iPSC richiedono una serie di passaggi diversi con protocolli ottimizzati negli ultimianni 1,6,35,36. Generalmente, i BMEC derivati da iPSC sono coltivati in mezzo Essential 6 (E6) per 4 giorni, seguiti da 2 giorni nel mezzo umano endoteliale senza siero (hESFM) integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), acido retinoico (RA) e integratore B27. Le cellule vengono quindi coltivate su una matrice di collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) per ottenere >90% BMEC omogenei1.
L'identità dei BMEC è confermata dall'immunofluorescenza che mostra la coesimozione di proteine BMEC tra cui molecola di adesione delle cellule piastrine-endoteliali-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteine di giunzione stretta come la proteina di giunzione stretta 1 (TJP1), l'occludina (OCLN) e la claudina-5 (CLDN5)6. I test di germinazione sono stati utilizzati per confermare il potenziale angiogenico dei BMEC derivati da iPSC. 6 L'integrità BBB dei BMEC è valutata dalla presenza di valori teer fisiologici in vitro (~2000Ω x cm2)37 e attività misurabile per trasportatori di efflux come ABCB1 e ABCC11,6,36. I recenti progressi metodologici del gruppo Lippmann hanno portato a protocolli BMEC derivati da iPSC con ridotta variabilità sperimentale e maggiore riproducibilità1. Tuttavia, non è noto se possano essere espansi e superati oltre lo stadio di sotto-ristrutturazione. Il nostro protocollo modificato mira ad affrontare questo problema passando i BMEC derivati da iPSC oltre il giorno 8 e valutando se possono essere ulteriormente ampliati per mantenere le proprietà BBB dopo la crioconservazione. Sebbene nessuno studio abbia descritto la passaging di BMEC derivati da iPSC, esiste un protocollo per la crioconservazione BMEC che mantiene proprietà fisiologiche BBB dopo aver subito un ciclo di congelamento-disgelo40. Tuttavia, non è noto che i BMEC post-crioconservazione possano essere passaggi e mantenere le proprietà BBB.
I BPC derivati da iPSC che utilizzano il protocollo Lippmann sono stati utilizzati per modellare l'interruzione della BBB in disturbi neurologici come la malattia di Huntington7. Tali BMEC derivati da iPSC sono stati utilizzati anche per indagare gli effetti di infezioni batteriche come Neisseria meningitidis o Gruppo B Streptococcus sull'interruzione della barriera ematica-CSF e BBBrispettivamente 41,42. Inoltre, utilizzando BMEC derivati da iPSC da pazienti con sindrome da cancellazione di 22q con schizofrenia, i ricercatori hanno osservato un aumento della molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una delle principali molecole di adesione nei BMEC che aiutano con il reclutamento e l'estravasione dei leucocitinel cervello 43. Nel loro insieme, questi studi dimostrano l'utilità di BMEC derivati dall'iPSC per lo studio dell'interruzione della BBB nei disturbi neuropsichiatrici complessi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) possono essere differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) per sviluppare modelli cellulari ex vivo per lo studio della funzione della barriera eculare-encefalica (BBB). Questo protocollo modificato fornisce passaggi dettagliati per ricavare, espandere e crioconservare IPC dagli iPSC umani utilizzando un donatore e reagenti diversi da quelli riportati nei protocolli precedenti. Gli iPSC vengono trattati con 6 mezzi essenziali per 4 giorni, seguiti da 2 giorni di mezzo di coltura senza siero endoteliale umano integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base, acido retinoico e integratore B27. Al giorno 6, le cellule vengono sotto-coltivate su una matrice di collagene / fibronectina per 2 giorni. L'immunocitochimica viene eseguita al giorno 8 per l'analisi dei marcatori BMEC utilizzando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. Il western blotting viene eseguito per confermare l'espressione del marcatore BMEC e l'assenza di SOX17, un marcatore endodermico. Il potenziale angiogenico è dimostrato con un saggio di germogliazione. La resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) viene misurata utilizzando elettrodi a bacchetta e voltohmmetro a partire dal giorno 7. L'attività del trasportatore Efflux per la sottofamiglia di cassette di binding ATP B membro 1 e la sottofamiglia di cassette di binding ATP C membro 1 viene misurata utilizzando un lettore multi-piastra al giorno 8. Una derivazione riuscita dei BMEC è confermata dalla presenza di marcatori cellulari rilevanti, bassi livelli di SOX17, potenziale angiogenico, attività del trasportatore e valori TEER ~2000 Ω x cm2. I BMEC vengono espansi fino al giorno 10 prima di passare su piastre di collagene/fibronectina appena rivestite o crioconservate. Questo protocollo dimostra che i BMEC derivati da iPSC possono essere espansi e passaggi almeno una volta. Tuttavia, dopo la crioconservazione sono stati osservati valori TEER più bassi e una localizzazione più scarsa dei marcatori BMEC. I BMEC possono essere utilizzati in esperimenti di co-coltura con altri tipi di cellule (neuroni, glia, periciti), in modelli cerebrali tridimensionali (organ-chip e idrogel), per la vascolarizzazione degli organoidi cerebrali e per lo studio della disfunzione BBB nei disturbi neuropsichiatrici.

Differenziazione BMEC È necessario seguire con precisione alcuni passaggi critici di questo protocollo (figura 1). L'uso medio E6 il primo giorno è importante, poiché viene spesso utilizzato per derivare il lignaggio neuroectoderma dagli IPSC in un periodo di tempo relativamente breve producendo risultati riproducibili su più lineecellulari 36. Un altro passo importante è il giorno 4 della differenziazione, dove il mezzo E6 dovrebbe essere pas...

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Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo adattato per derivare, espandere e crioconservare le cellule endoteliali microvascolari cerebrali ottenute differenziando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e per studiare le proprietà della barriera eculare nel sangue in un modello ex vivo.

Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

BMECs generated from iPSC provide new experimental models for studying blood brain barrier function and dysfunction. We have used this protocol to examine whether BMECs retain their barrier properties after expansion and cryopreservation. This technique enables the generation of disease-specific BMECs from patients with disorders in which blood-brain barrier disruption plays a role in the pathophysiology of disease.To induce BMEC differentiation from human iPSCs, wash the confluent iPSC culture with DPBS one time before incubating the cells with the appropriate volume of enzymatic EDTA for approximately five minutes at 37 degrees Celsius. When a single cell suspension has been obtained collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in an appropriate volume of stem cell medium supplemented with 10 micromolar ROCK inhibitor for counting. Dilute the cells to 1.56 times 10 to the fourth cells per cubic centimeter concentration and seed two milliliters of cells into individual wells of a six-well flat bottom.After 24 hours in the cell culture incubator replace the supernatant in each well with E6 medium and return the plate to the incubator for four more days. To purify the iPSC-derived BMECs, coat the subculturing plates with the appropriate volume of a freshly prepared collagen IV and fibronectin solution per well and incubate the plates for a minimum of two hours at 37 degrees Celsius. On day six of differentiation collect the cells by centrifugation and resuspend the pellets in the appropriate volume of fresh human endothelial serum-free medium supplemented with B27, basic fibroblasts growth factor, and retinoic acid.For TEER analysis, plate the differentiated cells into each well of a collagen and fibronectin coated 12-transwell filtered plate. For efflux transporter activity analysis, plate the cells into each well of a collagen and fibronectin coated 24-well flat bottom plate. After 24 hours of subculture, replace the supernatant in each well with fresh human endothelial serum-free medium supplemented only with B27 supplement.To measure the blood brain barrier properties of the BMECs using TEER, charge the TEER instrument overnight and lightly wipe the instrument and chopstick electrodes with 70%ethanol before placing them into the safety hood. Switch on the power and calibrate the ohm meter according to the manufacturer's specifications. Plug in the electrodes and rinse them one time with 70%ethanol and one time with DPBS.Place the shorter end of the electrode into the atypical chamber of the insert and the longer end into the basolateral chamber of a blank well. After measuring the negative control response, quickly rinse the electrodes as demonstrated and measure the first experimental well. After all of the measurements have been recorded rinse chopstick electrodes again, gently wipe the electrodes and let them air dry in the safety hood.To assess the efflux transporter activity of the cells, on day eight of culturing treat the appropriate number of wells with a 10 micromolar efflux transporter inhibitor solution and place in an incubator for one hour at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, treat the cells with a 10 micromolar efflux transporter substrate solution for one hour in the incubator. At the end of the incubation, wash each well twice with 500 microliters of DPBS per well before lysing the cells with 500 microliters DPBS supplemented with 5%Triton-X per well.After five minutes, use a microplate reader to measure the fluorescence of the lysed cells at a 485 nanometer excitation and a 530 nanometer emission. For wells not used in the transporter assay, wash the cells twice with DPBS before fixing with 4%paraformaldehyde per cell nuclei quantification. After one day of culture in E6 medium, the cell morphology is similar to that of iPSCs.By day four, the cells are visibly distinct from iPSCs and cover most of the well. Two days of culture in human endothelial serum-free medium induces an elongated and cobblestone appearance in the cells. At day eight, individual cells form a mostly large cobblestone pattern.A sprouting assay can be performed to demonstrate the angiogenic potential of iPSC-derived BMECs. This leads to the development of tube-like structures after three days of growth factor treatment. The iPSC-derived BMECs generated using this protocol co-expressed tight junction proteins expressed in endothelial cells in the brain, lung, liver, and kidney, as well as vascular endothelial markers expressed at the blood brain barrier.As observed, 48 hours after subculture and medium change iPSC-derived BMECs demonstrate TEER values within the range described for iPSC-derived BMECs that were co-cultured with rat primary astrocytes. Efflux transporter activity was also observed at this stage. After cryopreservation, TEER measurements are lower compared to freshly derived BMECs.Western blot analysis reveals reduced levels of tight junction markers, such as occludin, while immunocytochemistry shows freckled and or frayed patterns of tight junction proteins. A too high or too low iPSC density will affect the differentiation efficiency and impact the development of appropriate blood brain barrier properties. This method enables the investigation of barrier properties cellular signaling and transporter activity using individualized BMECs to model the physiology and pathophysiology of the blood-brain barrier function.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Ricerca

Neuroscienze

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...