Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

この研究は、国立精神衛生研究所の新しい科学者のためのバイオビヘイビア研究賞(BRAINS)賞R01MH113858(R.K.へ)、国立衛生研究所賞KL2 TR002542(PL)によってサポートされました。国立精神衛生研究所臨床科学者開発賞K08MH086846(R.K.へ)、シドニーRベアJr財団グラント(P.L.)ドリスデューク慈善財団臨床科学者開発賞(R.K.)、ライアン・リヒト・サン・バイポーラ財団(R.K.)、フィリス&amp; ジェローム・ライル・ラッパポート財団(R.K.)、ハーバード幹細胞研究所(R.K.へ)、スティーブ・ウィリスとエリッサ・フロイト(R.K.へ)。私たちは、彼女の批判的な読書と原稿に関するフィードバックのためにアニー・カトゥリア博士に感謝します。

ヒトiPSCは、マサチューセッツ総合病院およびマクリーン病院の機関審査委員会によって承認されたプロトコルを使用して健康なドナーの線維芽細胞から再プログラムされ、以前の研究44、45、46に記載されているように特徴付けられる。
注:簡単に言えば、線維芽細胞は、mRNAベースの遺伝的リプログラ?...

変更とトラブルシューティング
このプロトコルでは、BMECsの誘導のためにiPSC培養中に一般的に使用される細胞外マトリックスおよび細胞培養培地を使用する際にいくつかの変更を加えた(図1)。これらの変更は、Lippmann プロトコル1に記載されているように、ヒト iPSC から BMECS を導出する能力に影響を与えませんでした?...

血液脳関門機能 血液脳関門(BBB)は、血液から脳への物質の移動を制限する境界を形成する。BBBは、血管系を裏打ちする単層を形成する脳内血管内皮細胞(BMEC)で構成される。BMECは、アストロサイト、ニューロン、ペリサイト、ミクログリア、および細胞外マトリックスと共に、神経血管ユニットを形成する。BMECは、BBBが高い経皮電気抵抗(TEER)を維持することを可能にする厳しく調節されたパラセルラー構造を有し、受動拡散を制限し、バリア完全性1、2の指標として機能する。BMECsはまた、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、およびトランスマイグレーションなどの細胞間移動を助けるタンパク質、ならびに免疫応答3中の白血球の飛散を助けるタンパク質を有する。BMECは、脳内の恒育的バランスを維持するために、廃棄物の栄養と除去のために流入および流出輸送器に依存しています3.例えば、溶質キャリアファミリー2メンバー1(SLC2A1)は、BBB4を横切るグルコースの移動を担う流入トランスポーターであり、ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1(ABCB1)およびATP結合カセットサブファミリーCメンバー1(ABCC1)などの流出トランスポーターは、基材を血流3、5、6、7に戻す責任を負う。ABCB1基質は、モルヒネ、ベラパミル4、オランザピンおよびリスペリドン8などの抗精神病薬を含み、一方、ABCC1トランスポーターは、硫酸コンジュゲート、ビンクリスチン、グルクロニド共役体4を含む様々な基質を有する。
精神障害におけるBBBモデルの応用 BBB機能障害は、統合失調症および双極性障害9,10を含む多くの神経学的および精神疾患に関与している。近年、iPSC由来のex vivo細胞モデルは、精神疾患の細胞および分子基盤を問い合わせるのに利用されているが、これらのモデルは現在、神経血管系11、12、13が果たす潜在的な役割を考慮していない。血液中を循環する末梢炎症性サイトカインがBBB14、15、16、17に悪影響を及ぼす可能性があると仮定されているが、細胞内18、19、20、21、22、トランスセルラー23、24、25、26、27、28、29、および細胞外マトリックス20、29、302、32に対する異常を示す証拠もある。 BBBの破壊は、血液の内容物が脳実質に入り、アストロサイトおよび/またはミクログリアを活性化して炎症性サイトカインを放出し、脳34に有害な影響を及ぼし得る炎症反応33を開始する。BMECはBBBの主要な構成要素であり、これらの細胞の構造および機能を調べることは、神経学的および精神障害におけるBBB機能不全の理解を高めることができる。
代替BMECモデル iPSC1,6,35,36からBMECを導出するための効率的なプロトコルが開発される前に、研究者はBBB機能を研究するために不死化BMEC37を採用していました。しかしながら、これらのモデルの多くは望ましいBBB型を達成することができず、このようなTEER値の生理学的範囲は38,39である。iPSCを利用することは、細胞が由来する個体の遺伝的背景を保持するという利点がある。科学者たちは、人間の脳の構造と機能を再現するiPSC由来のex vivo微小環境モデルの確立に積極的に取り組んでいます。研究者たちは、生体内で見つかったBMECsと構造的および生理的に類似したBMECを導き出す方法を開発した。iPSC由来BMECの精製集団を得るための方法は、プロトコルが過去数年間に最適化されているいくつかの異なるステップを必要とします1,6,35,36.一般に、iPSC由来BMECは、エッセンシャル6(E6)培地で4日間培養され、続いてヒト内皮無血清培地(hESFM)に塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、レチノイン酸(RA)、およびB27サプリメントを添加して2日間培養する。次に、細胞をコラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスで培養し、90%均質BMECs1を得る。
BMECの同一性は、血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM1)、SLC2A1、およびタイト接合タンパク質1(TJP1)、閉塞子タンパク質(OCLN)、およびクローディン-5(CLDN)6などの緊密な接合タンパク質を含むBMECタンパク質の共発現を示す免疫蛍光によって確認される。発芽アッセイは、iPSC由来BMECの血管新生電位を確認するために使用されてきた。6 BMECのBBB完全性は、ヒロインテエル値(〜2000Ω xcm2)37の存在とABCB1およびABCC11、6、36などの流出トランスポーターに対する測定可能な活性によって評価される。Lippmannグループによる最近の方法論的進歩は、実験変動性の低下と再現性の強化を伴うiPSC由来のBMECプロトコルに至った。しかし、彼らがサブ培養段階を超えて拡大し、通過できるかどうかは不明である。私たちの変更されたプロトコルは、8日目以降にiPSC由来のBMECを渡し、凍結保存後にBBBプロパティをさらに拡張できるかどうかを評価することによって、この問題に対処することを目指しています。iPSC由来BMECの経食について記述した研究はないが、凍結融解サイクル40を受けた後に生理学的BBB特性を保持するBMEC凍結保存のためのプロトコルが存在する。しかし、凍結保存後BMECを通過させ、BBB特性を保持できることは知られていない。
Lippmann プロトコルを使用して iPSC から派生した BMEC は、ハンチントン病などの神経疾患における BBB 破壊をモデル化するために利用されてきた7.このようなiPSC由来BMECは、それぞれ41,42の血液CSFバリア及びBBBの破壊に対するナイセリア髄膜炎又はB群連鎖球菌などの細菌感染の影響を調べるためにも用いられている。また、統合失調症患者の22q欠失症候群患者からのiPSC由来BMECを用いて、研究者は、脳43への白血球の募集および外挿を補助するBMECの主要な接着分子である細胞間接着分子-1(ICAM-1)の増加を観察した。これらの研究をまとめると、複雑な神経精神疾患におけるBBB破壊を研究するためのiPSC由来BMECの有用性を示す。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

脳内血管内皮細胞(BMEC)は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から分化し、血液脳関門(BBB)機能を研究するためのex vivo細胞モデルを開発することができます。この変更されたプロトコルは、以前のプロトコルで報告されたものとは異なるドナーと試薬を使用して、ヒトのiPSCからBMECを導き出し、拡張し、凍結保存するための詳細な手順を提供します。iPSCは必須6培地で4日間処理され、続いて2日間のヒト内皮無血清培地に塩基性線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、およびB27サプリメントを添加した。6日目に、細胞をコラーゲン/フィブロネクチンマトリックス上で2日間分培養する。免疫細胞化学は、CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1、およびSLC2A1を用いたBMECマーカー分析のために8日目に行われる。ウェスタンブロッティングは、BMECマーカー発現を確認するために行われ、および、内皮マーカーであるSOX17の不存在を確認する。血管形成の可能性は、発芽アッセイで実証される。7日目から箸電極と電圧計を用いて、電気抵抗(TEER)を使用して、内皮間を越えた電気抵抗(TEER)を測定します。ATP結合カセットサブファミリーB部ファミリーB部材1及びATP結合カセットサブファミリーC部材1に対する流出トランスポーター活性は、8日目にマルチプレートリーダーを用いて測定される。BMECsの誘導に成功した、関連する細胞マーカーの存在によって確認され、SOX17の低レベル、血管新生電位、トランスポーター活性、およびTEER値〜2000 Ω xcm2。BMECは、コーティングされたばかりのコラーゲン/フィブロネクチンプレートまたは凍結保存に加える前に、10日目まで拡張されます。このプロトコルは、iPSC由来のBMECを少なくとも1回拡張して通行できることを示しています。しかしながら、凍結保存後に、低いTEER値およびBMECマーカーの局在化不良が観察された。BMECは、他の細胞タイプ(ニューロン、グリア、ペリサイト)、3次元脳モデル(オルガンチップおよびヒドロゲル)、脳オルガノイドの血管化、および神経精神疾患におけるBBB機能障害の研究に使用できます。

BMEC差別化 このプロトコルのいくつかの重要な手順は正確に実行する必要があります (図 1) 。1日目のE6培地使用は重要であり、比較的短時間でiPSCから神経外発性系統を導出するために用いられることが多いため、複数の細胞株36にわたって再現可能な結果を生み出す。もう一つの重要なステップは、E6培地が希釈された(1:200)B27、20 ng / mL b...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo モデルにおける血液脳関門特性を研究するための適応法を詳述する。

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

死後ヒト脳ドナーから軟膜植片培養物の導出

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...