Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio R01MH113858 (para R.K.), do National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS), r01MH113858 (para R.K.), prêmio kl2 TR002542 (PL). um National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (para R.K.), um Sydney R Baer Jr Foundation Grant (para P.L.) o Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (para R.K.), a Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (para R.K.), o Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (para R.K.), o Harvard Stem Cell Institute (para R.K.) e por Steve Willis e Elissa Freud (para R.K.). Agradecemos à Dra.

Os iPSCs humanos foram reprogramados dos fibroblastos de doadores saudáveis por meio de protocolo aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional do Hospital Geral de Massachusetts e do Hospital McLean, e caracterizados como descritos em estudos anteriores44,45,46.
NOTA: Brevemente, os fibroblastos foram reprogramados para o iPSC através da reprogramação genética baseada em mRNA<sup class="xre...

Modificações e solução de problemas
Neste protocolo, fizemos algumas modificações no uso de uma matriz extracelular comumente usada e meios de cultura celular durante a cultura iPSC para derivação de BMECs (Figura 1). Essas mudanças não impactaram a capacidade de derivar BMECS de iPSCs humanos, conforme descrito no protocolo Lippmann1. Uma linha iPSC de um doador saudável diferente foi usada para demonstrar que e...

Função de barreira hemencefálica A barreira hemencefálica (BBB) forma um limite que limita o movimento de substâncias do sangue para o cérebro. O BBB é composto por células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) que formam uma monocamada que reveste a vasculatura. BMECs, juntamente com astrócitos, neurônios, periciosos, microglia e matriz extracelular, formam a unidade neurovascular. Os BMECs possuem uma estrutura paracelular bem regulada que permite ao BBB manter alta resistência elétrica trans-endotelial (TEER), que limita a difusão passiva e serve como indicador de integridade da barreira1,2. Os BMECs também possuem proteínas que auxiliam no movimento transcelular, como endocitose, transcitose e transmigração, bem como extravasação de leucócitos durante uma resposta imune3. Os BMECs contam com transportes de influxo e efflux para nutrição e remoção de resíduos, a fim de manter um equilíbrio homeostático no cérebro3. Por exemplo, a família transportadora solute 2 membro 1 (SLC2A1) é um transportador de fluxo responsável pelo movimento de glicose através do BBB4, enquanto transportadores efflux como o subfamília de de ligação ATP membro B (ABCB1) e o membro C da fita c de ligação ATP 1 (ABCC1) são responsáveis por devolver substratos de volta à corrente sanguínea3,5,6,7. Os substratos ABCB1 incluem morfina, verapamil4e antipsicóticos como olanzapina e risperidona8,enquanto o transportador ABCC1 possui uma variedade de substratos, incluindo conjugados de sulfato, vincristina e conjugados de glucuronídeos4.
Aplicação de Modelos BBB em Transtornos Psiquiátricos A disfunção bbb tem sido implicada em uma série de transtornos neurológicos e psiquiátricos, incluindo esquizofrenia e transtorno bipolar9,10. Recentemente, modelos celulares ex vivo derivados do iPSC estão sendo utilizados para interrogar os fundamentos celulares e moleculares de transtornos psiquiátricos, mas esses modelos atualmente não levam em conta o potencial papel desempenhado pela neurovasculatura11,12,13. É hipótese que citocinas inflamatórias periféricas que circulam no sangue podem impactar negativamente o BBB14,15,16,17, mas também há evidências de paracelular18,19,20,21,122, transcelular23,24,25,26,27,28,29, e matriz extracelular20,29,30,31,32 anormalidades contribuindo para a disfunção BBB. A interrupção do BBB pode resultar no conteúdo do sangue entrando no parenchyma cerebral e ativando astrócitos e/ou microglia para liberar citocinas proinflamatórias, que por sua vez iniciam uma resposta inflamatória33 que pode ter efeitos prejudiciais no cérebro34. Os BMECs são o componente primário do BBB e examinar a estrutura e a função dessas células pode melhorar a compreensão da disfunção BBB em transtornos neurológicos e psiquiátricos.
Modelos alternativos de BMEC Antes do desenvolvimento de protocolos eficientes para o eduque de BMECs dos iPSCs1,6,35,36, os pesquisadores haviam empregado BMECsimortalizados 37 para estudar a função BBB. No entanto, muitos desses modelos não conseguiram alcançar fenótipos BBB desejáveis, uma gama fisiológica de valores TEER38,39. Utilizar iPSCs tem a vantagem de manter o fundo genético do indivíduo do qual as células são derivadas. Os cientistas estão trabalhando ativamente no estabelecimento de modelos de microambiente ex vivo derivados do iPSC que recapitulem a estrutura e a função do cérebro humano. Pesquisadores desenvolveram métodos para derivar BMECs que são estruturalmente e fisiologicamente semelhantes aos BMECs encontrados in vivo. Os métodos para a obtenção de populações purificadas de BMECs derivados do iPSC exigem uma série de etapas diferentes, com protocolos sendo otimizados nos últimos anos1,6,35,36. Geralmente, os BMECs derivados do iPSC são cultivados em meio Essential 6 (E6) por 4 dias, seguidos por 2 dias em meio endotelial-livre de soro humano (hESFM) complementados com fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF), ácido retinóico (RA) e suplemento B27. As células são então cultivadas em uma matriz de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) para obter >90% BMECs homogêneos1.
A identidade dos BMECs são confirmadas pela imunofluorescência que mostra a co-expressão de proteínas BMEC, incluindo molécula de adesão celular plaquetária-endotelial-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteínas de junção apertadas como proteína de junção apertada 1 (TJP1), occludina (OCLN) e claudin-5 (CLDN5)6. Ensaios de broto têm sido usados para confirmar o potencial angiogênico de BMECs derivados do iPSC. 6 A integridade BBB dos BMECs é avaliada pela presença de valores fisiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 e atividade mensurável para transportadores de efflux como ABCB1 e ABCC11,6,36. Os recentes avanços metodológicos do grupo Lippmann levaram a protocolos BMEC derivados do IPSC com variabilidade experimental reduzida e reprodutibilidade aprimorada1. No entanto, não se sabe se eles podem ser expandidos e passagens para além do estágio de subcultura. Nosso protocolo modificado visa resolver esse problema, aprovando BMECs derivados do iPSC para além do dia 8 e avaliando se eles podem ser expandidos para reter propriedades BBB após a criopreservação. Embora nenhum estudo tenha descrito a passagem de BMECs derivados do iPSC, existe um protocolo para a criopreservação BMEC que retém propriedades fisiológicas do BBB após passar por um ciclo de congelamento40. No entanto, não se sabe se BMECs pós-criopreservação podem ser passagens e reter propriedades BBB.
BMECs derivados de iPSCs usando o protocolo Lippmann têm sido utilizados para modelar a interrupção do BBB em distúrbios neurológicos como a doença de Huntington7. Esses BMECs derivados do iPSC também têm sido usados para investigar os efeitos da infecção bacteriana, como neisseria meningitidis ou Estreptococos do Grupo B na interrupção da barreira hemo-CSF eBBB, respectivamente 41,42. Além disso, usando BMECs derivados do iPSC de pacientes com síndrome de exclusão de 22q com esquizofrenia, os pesquisadores observaram um aumento na molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma molécula de adesão importante em BMECs que auxiliam no recrutamento e extravasação de leucócitos no cérebro43. Juntos, esses estudos demonstram a utilidade dos BMECs derivados do iPSC para estudar a interrupção do BBB em distúrbios neuropsiquiátricos complexos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

As células-tronco endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) podem ser diferenciadas das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) para desenvolver modelos celulares ex vivo para estudar a função de barreira hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado fornece etapas detalhadas para derivar, expandir e criopreservar BMECs de iPSCs humanos usando um doador e reagentes diferentes dos relatados em protocolos anteriores. Os iPSCs são tratados com meio essencial de 6 por 4 dias, seguidos por 2 dias de cultura endotelial-livre de soro humano complementada com fator básico de crescimento do fibroblasto, ácido retinóico e suplemento B27. No dia 6, as células são subculturadas em uma matriz de colágeno/fibronectina por 2 dias. A imunocitoquímica é realizada no dia 8 para análise de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. A mancha ocidental é realizada para confirmar a expressão do marcador BMEC, e a ausência de SOX17, um marcador endodérmico. O potencial angiogênico é demonstrado com um ensaio brotante. A resistência elétrica trans-endotelial (TEER) é medida usando eletrodos de pauzinho e voltohmômetro a partir do dia 7. A atividade de transporte da Efflux para o membro B da subfamília de fita 1 e atp de ligação c membro 1 é medida usando um leitor de várias placas no dia 8. A derivação bem sucedida de BMECs é confirmada pela presença de marcadores celulares relevantes, baixos níveis de SOX17, potencial angiogênico, atividade de transporte e valores TEER ~2000 Ω x cm2. Os BMECs são expandidos até o dia 10 antes de passar para placas de colágeno/fibronectina recém-revestidas ou criopreservadas. Este protocolo demonstra que os BMECs derivados do iPSC podem ser expandidos e passagens pelo menos uma vez. No entanto, foram observados valores de TEER mais baixos e pior localização dos marcadores BMEC após a criopreservação. Os BMECs podem ser utilizados em experimentos de co-cultura com outros tipos de células (neurônios, glia, pericytes), em modelos cerebrais tridimensionais (organ-chip e hidrogel), para vascularização de organoides cerebrais, e para estudar a disfunção BBB em distúrbios neuropsiquiátricos.

Diferenciação BMEC Alguns passos críticos neste protocolo devem ser seguidos com precisão(Figura 1). O uso médio do E6 no dia 1 é importante, uma vez que é frequentemente usado para obter linhagem neuroectoderme de iPSCs dentro de um período relativamente curto de tempo produzindo resultados reprodutíveis em múltiplas linhas celulares36. Outro passo importante é no dia 4 de diferenciação, onde o meio E6 deve ser trocado para hESFM com ...

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Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Este protocolo detalha um método adaptado para derivar, expandir e criopreservar células microvasculares microvasculares cerebrais obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e para estudar as propriedades da barreira cerebral no sangue em um modelo ex vivo.

Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Neurociência

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...