Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным институтом психического здоровья Биобехавиоальные исследования Награды для инновационных новых ученых (BRAINS) Премия R01MH113858 (К.К.), Национальные институты здравоохранения премии KL2 TR002542 (PL). Национальный институт психического здоровья клинического научного развития премии K08MH086846 (в Р.К.), Сидней R Baer Jr Фонд Грант (P.L.) Дорис Дьюк Благотворительный фонд клинического научного развития премии (R.K.), Райан Лихт Сан Биполярный фонд (в Р.К.), Филлис и Джером Лайл Раппапорт Фонд (К.К.), Гарвардский институт стволовых клеток (R.K.) и Стив Уиллис и Элисса Фрейд (R.K.). Мы благодарим доктора Энни Катурию за ее критическое чтение и отзывы о рукописи.

Человеческие iPSCs были перепрограммированы из фибробластов здоровых доноров, используяпротокол,утвержденный Институциональный обзор советов Массачусетской больницы общего профиля и больницы Маклин, и характеризуется как описано впредыдущих исследованиях 44,<sup class=...

Модификации и устранение неполадок
В этом протоколе мы внесли некоторые изменения в использование широко используемой внеклеточной матрицы и средств культуры клеток во время культивирования iPSC для производных БМЕК(рисунок 1). Эти изменения не ?...

Функция гемово-мозгового барьера Гемово-мозговой барьер (BBB) образует границу, которая ограничивает движение веществ из крови в мозг. BBB состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга (BMECs), которые образуют монослой, выстилающий сосуды. БМЕК вместе со астроцитами, нейронами, перицитами, микроглией и внеклеточной матрицей образуют нервно-сосудистый блок. BMECs имеют жестко регулируемую параклеточную структуру, которая позволяет BBB поддерживать высокое транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), которое ограничивает пассивную диффузию и служит индикатором барьернойцелостности 1,2. BMECs также имеют белки, которые помогают с трансклеточного движения, такие как эндоцитоз, трансцитоз, и трансмиграции, а также экстравазии лейкоцитов во время иммунногоответа 3. BMECs полагаться на приток и эффлюкс транспортеров для питания и удаления отходов, для того, чтобы поддерживать гомеостатический баланс в головном мозге3. Например, solute перевозчика семьи 2 члена 1 (SLC2A1) является приток транспортер отвечает за движение глюкозы через BBB4, в то время как efflux транспортеры, такие как ATP связывания кассеты субсемейный член B 1 (ABCB1) и ATP связывания кассеты субсемейный член C 1 (ABCC1) несут ответственность за возвращение субстратов обратно в кровоток3,5,7. ABCB1 субстраты включают морфин, verapamil4, и антипсихотики, такие как оланзапин ирисперидон 8, в то время как транспортер ABCC1 имеет различные субстраты, включая сульфатные конъюгаты, винкристин, и глюкуронидконъюгирует 4.
Применение моделей BBB при психических расстройствах BBB дисфункция была вовлечена в ряд неврологических и психических расстройств, в том числе шизофрении и биполярногорасстройства 9,10. В последнее время, iPSC полученных ex vivo клеточных моделей в настоящее время используются для допроса клеточных и молекулярных основ психических расстройств, но эти модели в настоящее время не принимают во внимание потенциальную роль, которую играет нейроваскулатура11,12,13. Предполагается, что периферические воспалительные цитокины, циркулирующие вкрови,могут негативно повлиять на BBB14,15,16,17,но есть также доказательства для параклеточных18,19,20,21,22, трансцеллюлярные23,24,25,26,27,28,29,и внеклеточнойматрицы 20,29,30,31,32 аномалии способствует дисфункции BBB. Нарушение BBB может привести к содержанию крови, поступающих в мозг паренхима и активации астроцитов и / или микроглии, чтобы освободить провоспалительные цитокины, которые, в свою очередь, инициироватьвоспалительные реакции 33, которые могут иметь пагубные последствиядля мозга 34. BMECs являются основным компонентом BBB и изучения структуры и функции этих клеток может повысить понимание дисфункции BBB в неврологических и психических расстройств.
Альтернативные модели BMEC До разработки эффективных протоколов для получения BMECs от iPSCs1,6,35,36, исследователи использовали увековеченные BMECs37 для изучения функции BBB. Тем не менее, многие из этих моделей не смогли достичь желаемого BBB фенотипов, такой физиологический диапазон значений TEER38,39. Использование iPSCs имеет то преимущество, сохраняя генетический фон человека, из которого клетки получены. Ученые активно работают над созданием iPSC-производных ex vivo микросреду модели, которые резюмируют структуру и функцию человеческого мозга. Исследователи разработали методы для получения BMECs, которые структурно и физиологически похожи на BMECs найти in vivo. Методы получения очищенных популяций БМЕК, полученных из iPSC, требуют ряда различных шагов, при этом в последние нескольколет оптимизированы протоколы 1,6,35,36. Как правило, БМЕК, полученные iPSC, культурированы в среде Essential 6 (E6) в течение 4 дней, а затем в течение 2 дней в эндотелиальной сыворотке человека свободной среды (hESFM) дополняется основным фактором роста фибробластов (bFGF), ретинойной кислоты (RA), и B27 дополнения. Клетки затем культури на коллагена IV (COL4) и фибронектина (FN) матрицы для получения 90% однородных BMECs1.
Идентичность БМЕК подтверждается иммунофлуоресценцией, показывающей совместное выражение белков BMEC, включая тромбоцитно-эндотелиарную молекулу адгезии клеток-1 (PECAM1), SLC2A1, и жесткие белки соединения, такие как плотный белок соединения 1 (TJP1), occludin (OCLN) и claudin-5 (CLDN5)6. Прорастание анализы были использованы для подтверждения ангиогенного потенциала IPSC полученных БМЕК. 6 Целостность BMECs BBB оценивается наличием физиологических значений IN vitro TEER (2000 х см2) 37иизмеримой активностью для транспортеров эффлюкса, таких как ABCB1 и ABCC11,6,36. Недавние методологические достижения группы Lippmann привели к iPSC-производным протоколам BMEC с уменьшенной экспериментальной изменчивостью и повышенной воспроизводимостью1. Однако неизвестно, могут ли они быть расширены и выйти за пределы субподготовной стадии. Наш измененный протокол направлен на решение этой проблемы путем прохода BMECs, полученных iPSC, за 8-й день и оценки того, могут ли они быть дополнительно расширены, чтобы сохранить свойства BBB после криоконсервации. Хотя никакие исследования не описали прохождение IPSC полученных BMECs, протокол существует для криоконсервации BMEC, который сохраняет физиологические свойства BBB после прохождения замораживания оттепелицикла 40. Тем не менее, не известно, после криоконсервации BMECs могут быть провечены и сохранить свойства BBB.
BMECs, полученные из iPSCs с помощью протокола Lippmann были использованы для моделирования BBB нарушения неврологических расстройств, таких как болезнь Хантингтона7. Такие БМЕК, полученные iPSC, также использовались для исследования влияния бактериальной инфекции, такой как Neisseria meningitidis или Group B Streptococcus на нарушение гембо-CSF барьера и BBB соответственно41,42. Кроме того, используя IPSC полученных BMECs от 22q удаления синдрома пациентов с шизофренией, исследователи наблюдали увеличение межклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1), основные молекулы адгезии в BMECs, которые помогают с набором и экстравазиилейкоцитов в мозг 43. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют полезность IPSC полученных БМЕК для изучения BBB нарушения в сложных нейропсихиатрических расстройств.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

Микрососудистые эндотелиальные клетки мозга (BMECs) могут быть дифференцированы от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) для разработки ex vivo клеточных моделей для изучения функции гемового мозга барьера (BBB). Этот измененный протокол содержит подробные шаги по получению, расширению и криопресервированию БМЕК от человеческих iPSCs с использованием различных доноров и реагентов, чем те, которые сообщалось в предыдущих протоколах. iPSCs обрабатываются с существенным 6 средних в течение 4 дней, а затем 2 дней человека эндотелиальной сыворотки свободной культуры среды дополняется основным фактором роста фибробластов, ретинойной кислоты и B27 дополнения. В день 6, клетки суб-культурных на коллагена / фибронектина матрицы в течение 2 дней. Иммуноцитохимия проводится в день 8 для анализа маркеров BMEC с использованием CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 и SLC2A1. Западный blotting выполняется для подтверждения выражения маркера BMEC, и отсутствие SOX17, эндодермальный маркер. Ангиогенный потенциал демонстрируется с прорастания анализа. Транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измеряется с помощью электродов палочки и вольтомметра, начиная с 7-го дня. Деятельность транспортера Efflux для АТФ, связывающего кассетный субсемейный член B 1 и АТФ, связывающего кассетный субсемейный член C 1, измеряется с помощью многоэтажного считыватель на 8-й день. Успешное выведение BMECs подтверждается наличием соответствующих клеточных маркеров, низким уровнем SOX17, ангиогенным потенциалом, транспортерной активностью и значениями TEER 2000 Ω x cm2. BMECs расширены до дня 10 перед passaging на свежеокрашенных коллагена / фибронектина пластин или криоконсервированных. Этот протокол демонстрирует, что BMECs, полученные iPSC, могут быть расширены и пролететь по крайней мере один раз. Однако снижение значений TEER и более низкая локализация маркеров BMEC наблюдались после криоконсервации. БМЕК могут быть использованы в экспериментах совместной культуры с другими типами клеток (нейроны, глиа, перициты), в трехмерных моделях мозга (орган-чип и гидрогель), для васкуляризации органоидов мозга, а также для изучения дисфункции BBB при нейропсихиатрических расстройствах.

Дифференциация BMEC Следует точно следовать нескольким важным шагам в этом протоколе(рисунок 1). E6 среднего использования на день 1 имеет важное значение, так как он часто используется для получения нейроэктодерм линии от iPSCs в течение относительно короткого пе?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Этот протокол подробно адаптированный метод для получения, расширения и криопресервного мозга микрососудистых эндотелиальных клеток, полученных путем дифференциации человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, а также для изучения свойств гемового барьера мозга в модели ex vivo.

Вывод, Расширение, Криоконсервация и Характеристика микрососудистых эндотелиальных клеток мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

ЦГМФ-применимо Метод расширения для агрегатов человека нервных стволовых и предшественники клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или плода ткани головного мозга

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Режиссер дофаминергических Neuron Дифференциация от человека плюрипотентных стволовых клеток

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Выделение Первичная мышиный Brain Микрососудистой эндотелиальных клеток

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Выведение лептоменинкс эксплантата культур от посмертных доноров человеческого мозга

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...