Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por un Premio R01MH113858 del Instituto Nacional de Investigación Biobehavioral de Salud Mental para Nuevos Científicos Innovadores (BRAINS) R01MH113858 (a R.K.), premio KL2 TR002542 (PL) de los Institutos Nacionales de Salud. un Premio del Instituto Nacional de Desarrollo Científico Clínico de Salud Mental K08MH086846 (a R.K.), una Beca de la Fundación R Baer Jr de Sídney (a P.L.) el Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), la Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), el Instituto de Células Madre de Harvard (a R.K.) y por Steve Willis y Elissa Freud (a R.K.). Agradecemos a la Dra. Annie Kathuria por su lectura crítica y comentarios sobre el manuscrito.

Los iPSC humanos fueron reprogramados de los fibroblastos de donantes sanos utilizando un protocolo aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital General de Massachusetts y el Hospital McLean, y caracterizados como descritos en estudios anteriores44,45,46.
NOTA: Brevemente, los fibroblastos fueron reprogramados a iPSC a través de la reprogramación genética basada en ARNM<sup class...

Modificaciones y solución de problemas
En este protocolo, hicimos algunas modificaciones en el uso de una matriz extracelular de uso común y medios de cultivo celular durante la culturing iPSC para la derivación de BMECs (Figura 1). Estos cambios no afectaron a la capacidad de derivar BMECS de iPSC humanos como se describe en el Protocolo Lippmann1. Se utilizó una línea iPSC de un donante sano diferente para demostrar ...

Función de barrera hematoencefálica La barrera hematoencefálica (BBB) forma un límite que limita el movimiento de sustancias desde la sangre hasta el cerebro. El BBB se compone de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) que forman una monocapa que recubre la vasculatura. Los BMECs, junto con astrocitos, neuronas, pericitos, microglia y matriz extracelular, forman la unidad neurovascular. Los BMECs tienen una estructura paracelular estrictamente regulada que permite al BBB mantener una alta resistencia eléctrica transdotelial (TEER), que limita la difusión pasiva y sirve como indicador de la integridad de la barrera1,2. Los BMECs también tienen proteínas que ayudan con el movimiento transcelular como la endocitosis, la transcitosis y la transmigración, así como la extravasación de leucocitos durante una respuesta inmune3. Los BMECs dependen de la afluencia y los transportadores de eflujo para la alimentación y eliminación de productos de desecho, con el fin de mantener un equilibrio homeostatico en el cerebro3. Por ejemplo, solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) es un transportador de afluencia responsable del movimiento de glucosa a través del BBB4, mientras que los transportadores de efflux como el miembro B de casete de encuadernación ATP 1 (ABCB1) y el miembro C de la subfamilia de casete de unión ATP 1 (ABCC1) son responsables de devolver los sustratos de vuelta al torrente sanguíneo3,5,6,7. Los sustratos ABCB1 incluyen morfina, verapamil4,y antipsicóticos como olanzapina y risperidona8,mientras que el transportador ABCC1 tiene una variedad de sustratos incluyendo conjugados de sulfato, vincristina, y glucuronida conjuga4.
Aplicación de modelos BBB en trastornos psiquiátricos La disfunción del BBB se ha implicado en una serie de trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluyendo esquizofrenia y trastorno bipolar9,10. Recientemente, los modelos celulares ex vivo derivados de iPSC están siendo utilizados para interrogar los fundamentos celulares y moleculares de los trastornos psiquiátricos, pero estos modelos actualmente no tienen en cuenta el papel potencial desempeñado por la neurovasculatura11,12,13. Se presume que las citoquinas inflamatorias periféricas que circulan en la sangre pueden afectar negativamente al BBB14,15,16,17,pero también hay evidencia para paracelular18,19,20,21,22, transcelular23,24,25,26,27,28,29, y matriz extracelular20,29,30,31,32 anomalías que contribuyen a la disfunción BBB. La interrupción del BBB puede resultar en el contenido de la sangre que entra en el parénquima cerebral y la activación de astrocitos y/o microglia para liberar citoquinas proinflamatorias, que a su vez inician una respuesta inflamatoria33 que puede tener efectos perjudiciales en el cerebro34. Los BMECs son el componente principal del BBB y examinar la estructura y la función de estas células puede mejorar la comprensión de la disfunción del BBB en trastornos neurológicos y psiquiátricos.
Modelos ALTERNATIVOS BMEC Antes del desarrollo de protocolos eficientes para derivar BMECs de iPSCs1,6,35,36,los investigadores habían empleado BMECsinmortalizados 37 para estudiar la función BBB. Sin embargo, muchos de estos modelos no lograron fenotipos BBB deseables, tal rango fisiológico de valores TEER38,39. La utilización de iPSCs tiene la ventaja de conservar el fondo genético del individuo del que se derivan las células. Los científicos están trabajando activamente en el establecimiento de modelos de microambientes ex vivo derivados de iPSC que recapitulan la estructura y la función del cerebro humano. Los investigadores han desarrollado métodos para derivar BMECs que son estructural y fisiológicamente similares a los BMECs encontrados in vivo. Los métodos para obtener poblaciones purificadas de BMECs derivados de iPSC requieren una serie de pasos diferentes con protocolos optimizados en los últimos años1,6,35,36. Generalmente, los BMECs derivados de iPSC se cultivan en el medio esencial 6 (E6) durante 4 días, seguido de 2 días en el medio libre de suero endotelial humano (hESFM) complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico (bFGF), ácido retinoico (RA), y suplemento B27. A continuación, las células se cultivan en una matriz de colágeno IV (COL4) y fibronectina (FN) para obtener >90% BMECs homogéneos1.
La identidad de los BMECs se confirma mediante la inmunofluorescencia que muestra la coexpresión de las proteínas BMEC, incluida la molécula de adhesión de células plaquetarias-endoteliales-1 (PECAM1), SLC2A1 y proteínas de unión estrechas como la proteína de unión estrecha 1 (TJP1), la ocludina (OCLN) y claudin-5 (CLDN5)6. Los ensayos de brotes se han utilizado para confirmar el potencial angiogénico de los BMECs derivados de iPSC. 6 La integridad BBB de los BMECs se evalúa mediante la presencia de valores FIsiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 y actividad medible para transportadores de eflujo como ABCB1 y ABCC11,6,36. Los recientes avances metodológicos del grupo Lippmann han dado lugar a protocolos BMEC derivados de iPSC con menor variabilidad experimental y reproducibilidad mejorada1. Sin embargo, no se sabe si se pueden ampliar y pasar más allá de la etapa de sub-culto. Nuestro protocolo modificado tiene como objetivo abordar este problema pasando los BMECs derivados de iPSC más allá del día 8 y evaluando si se pueden ampliar aún más para conservar las propiedades de BBB después de la criopreservación. Aunque ningún estudio ha descrito la transferencia de BMECs derivados de iPSC, existe un protocolo para la criopreservación BMEC que retiene las propiedades fisiológicas de BBB después de someterse a un ciclo de congelación-deshielo40. Sin embargo, no se sabe después de la criopreservación BMECs se puede pasar y retener propiedades BBB.
Los BMECs derivados de iPSC utilizando el protocolo Lippmann se han utilizado para modelar la interrupción del BBB en trastornos neurológicos como la enfermedad de Huntington7. Estos BMECs derivados de iPSC también se han utilizado para investigar los efectos de la infección bacteriana como Neisseria meningitidis o Streptococcus del Grupo B en la interrupción de la barrera de la FSC en sangre y BBB respectivamente41,42. Además, utilizando BMECs derivados del iPSC de pacientes con síndrome de eliminación de 22q con esquizofrenia, los investigadores observaron un aumento de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), una molécula de adherencia importante en BMECs que ayudan con el reclutamiento y la extravasación de leucocitos en el cerebro43. En conjunto, estos estudios demuestran la utilidad de los BMECs derivados de iPSC para estudiar la interrupción del BBB en trastornos neuropsiquiátricos complejos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) para desarrollar modelos celulares ex vivo para estudiar la función de barrera hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado proporciona pasos detallados para derivar, expandir y criopreservar BMECs de iPSCs humanos utilizando un donante y reactivos diferentes a los notificados en protocolos anteriores. Los iPSC se tratan con esencial 6 medios durante 4 días, seguido de 2 días de cultivo endotelial humano libre de suero medio complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico, ácido retinoico, y suplemento B27. En el día 6, las células se sub-cultivan en una matriz de colágeno / fibronectina durante 2 días. La inmunocitoquímica se realiza en el día 8 para el análisis de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 y SLC2A1. La hinchazón occidental se realiza para confirmar la expresión del marcador BMEC y la ausencia de SOX17, un marcador endodérmico. El potencial angiogénico se demuestra con un ensayo que brota. La resistencia eléctrica transdotelial (TEER) se mide utilizando electrodos de palillo y voltohmómetro a partir del día 7. La actividad del transportador Efflux para la subfamilia de casete de enlace ATP miembro B 1 y miembro C del cassette de unión ATP se mide utilizando un lector multiplaque en el día 8. La derivación exitosa de BMECs se confirma mediante la presencia de marcadores celulares relevantes, bajos niveles de SOX17, potencial angiogénico, actividad transportadora y valores TEER ~2000 Ω x cm2. Los BMECs se expanden hasta el día 10 antes de pasar a placas de colágeno/fibronectina recién recubiertas o criopreservadas. Este protocolo demuestra que los BMECs derivados de iPSC se pueden ampliar y pasar al menos una vez. Sin embargo, se observaron valores TEER más bajos y una localización más pobre de los marcadores BMEC después de la criopreservación. BMECs se puede utilizar en experimentos de co-cultivo con otros tipos de células (neuronas, glia, pericitos), en modelos cerebrales tridimensionales (organ-chip e hidrogel), para la vascularización de organoides cerebrales, y para el estudio de la disfunción BBB en trastornos neuropsiquiátricos.

Diferenciación BMEC Algunos pasos críticos en este protocolo deben seguirse con precisión (Figura 1). E6 uso medio en el día 1 es importante, ya que se utiliza a menudo para derivar linaje neuroectoderm de iPSCs dentro de un período relativamente corto de tiempo que produce resultados reproducibles a través de múltiples líneas celulares36. Otro paso importante es el día 4 de la diferenciación, donde el medio E6 debe cambiarse a hESFM con ...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Este protocolo detalla un método adaptado para derivar, expandir y criopreservar las células endoteliales microvasculares cerebrales obtenidas diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por humanos, y para estudiar las propiedades de la barrera hematoencefálica en un modelo ex vivo.

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Investigación

Neurociencias

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...