このプロトコルの全体的な目標は、浸透圧ポンプで脳カニューラを使用し、挑戦的な運動タスクを介してストレスを誘発することによってDYT/PARK-ATP1A3ジストニアの症候性、薬理学的マウスモデルを確立することに関与する手順を記述することです。この方法は、複数の脳カニューレへの浸透圧ポンプを介した慢性薬物送達を用いた薬理学的マウスモデルの確立方法と、挑戦的な運動タスクを介して表現型を誘導する方法を詳述する。軽度の運動ストレスパラダイムはまた、運動障害における遺伝子環境相互作用の役割に関する洞察を提供し、他のげっ歯類モデルに適用することができる。
動物実験は、動物のケアおよび使用に関する適用可能な国家および制度的ガイドラインに従って行われた。滅菌環境で浸透圧ポンプを準備し始めます。まず、1ミリリットルのシリンジに27ゲージ充填カニューレを無菌濾過ワバン溶液または車両溶液で充填します。
浸透圧ポンプを直立した位置に保持し、カニューレをポンプに挿入し、余分な溶液が上に現れるまでゆっくりと貯水池を満たします。次に、フローモデレータをポンプに挿入します。フローモデレータの白いフランジをはさみで慎重に外し、ビニールチューブをフローモデレーターに接続します。
各ポンプを生理食動物溶液で満たしたエペンドルフチューブに沈め、サーモサイクラー37度に入れて、ポンプ速度が手術を開始する前に安定した状態に達するようにします。承認されたプロトコルに従って動物を深く麻酔した後、動物を定位フレームに入れ、ゴムチップまたは非破裂した耳棒を使用して頭部を固定します。外科領域を徹底的に消毒した後、メスを使って頭の上部に切開を配置し、はさみを使用して前肢まで切開を続ける。
ブルドッグクランプの助けを借りて頭蓋骨を露出させ、滅菌綿先端アプリケーターで骨膜を拭きます。脳のカニューレの3つの入り口点を、黒いインクで染まったペンまたはカニュールの先端をブレグマで揃え、適切な座標を使用して、頭蓋骨の脳カニューレの3つのエントリポイントをマークします。次に、大脳大脳に指定された二重カニューラと小脳用に指定された単一のカニューレの穴を慎重に掘削します。
線条体と小脳の間の小さなネジのために4番目の穴を開けます。このねじは最終的に歯科用セメントに埋め込まれ、カニューラのための追加のホールドを提供する。動物の両側の浸透圧ポンプ用の小さなポケットを作るためには、組織鉗子を使用して皮下組織層を分離する。
鉗子を後ろ脚に向かって進め、皮下ポケットを広げるために鉗子をわずかに開けます。反対側でも同じ手順を繰り返し、最初に切開から鉗子を取り除き、次に第2後脚に向かってそっと押します。鉗子の助けを借りて、慎重に各皮下ポケットにポンプと接続されたカテーテルを挿入します。
ポケットはポンプが容易に滑り込むことを可能にするべきである。ミニポンプホルダーを使用して、小脳の正中線に掘削された穴に3.0ミリメートルのカスタム長さの単一の浸透カニューレを導入します。カニューレヘッドを慎重に取り外し、カニューレと小さなネジを歯科用セメントで固定し、浸透ポンプのチューブ用の接続部分を覆わないように注意してください。
カニューレを取り巻く歯科医のセメントが完全に乾燥していることを確認してから手術を続けます。二重カニューレを大脳基底核の上に掘削された穴に挿入する前に、2つの0.5センチメートルの長さのビニールチューブをダブルカニューレの2つの接続部分に取り付けます。ビニルチューブを分岐アダプターで接続し、チューブシステム全体に無菌ワバン溶液または車両を慎重に事前に事前に充填します。
次に、二重カニューレを歯科用セメントで固定することにより、単一カニューレとエンドに対して前述と同じ手順を繰り返します。浸透圧ポンプのカテーテルを分岐アダプターに接続し、それぞれ単一のカニューレに接続します。両方のポンプは等しい流量を持っているので、同じ濃度が大脳基底核と小脳の両方に達することを確実にするために、二重濃縮溶液を二重濃縮溶液で接続するように注意してください。
皮膚を伸ばすことなく、できるだけステッチで動物の背中の切開を閉じます。皮下に無菌生理食い物を注入します, 脱水を避けるために体温を持っている必要があります.動物を立体性フレームから取り出し、回収ケージに入れます。
ジストニア様運動を誘発するためには、ワバーンを透過させたマウスは、手術後4時間ごとに軽度のストレスパラダイムとして挑戦的な運動タスクにさらされ、その後24時間ごとに繰り返し行われるべきである。これには、動物の行動特性は含まれません。ここでは、50センチメートルの粗い表面の木製ポールの上に置かれ、鼻を下向きにした車両を浸透させた動物の例を示します。
落下時には、ポールの底部に十分な寝具を用意します。ワバンを透過させたマウスの場合、動物は手術後4時間でブラジキネシアのような最初の症状を提示し始めるべきである。しかし、手術後24時間後、下降時のジストニア様運動の徴候として、前肢または後肢の不随意過伸展を見るべきです。
マウスは極を3回降下させ、各降下の間に少なくとも2分間の回復を可能にするべきである。降下時間を測定する必要はありません。ポールテストは、回転ロッドを使用して、第二のモータタスクが続く必要があります。
ロタロッド性能試験で行われたように、ストレス群のワバンマウスと車両透過マウスは回転ロッドに配置されます。落下までの待ち時間を測定する必要はありません。前のテストで行ったように、マウスは回転ロッドに3回置かれ、2分間の回復を可能にする。
修飾ジストニア評価スケールは、マウスのジストニアのような動きの頻度、重症度、および身体分布を評価するために使用することができる。動物はプラスチックまたは木箱に入れ、動きは4分間記録されるべきです。評価者は、グループの割り当てに目を見えない必要があります。
ジストニアのような動きや姿勢は、前肢の不随意過伸展、広い姿勢、後肢の過伸展、およびキフォシスである。1つの身体部分のみが影響を受ける場合、ジストニアは焦点とみなされるべきです。体幹と少なくとも2つの他の身体部分が影響を受ける場合、ジストニアは一般化と見なされるべきです。
新たに開発された2番目のスコアリングシステムは、テールサスペンションテスト中のジストニア様運動の有無と重症度を評価します。テストの場合は、マウスをベース付近の尻尾で2分間押し上げてください。テールサスペンションテストを記録し、その後の映像の分析にスコアを割り当てることをお勧めします。
前肢はゼロから4ポイントに得点されます。両方の前肢の1つの反復または持続的な強壮剤の引き込み、ならびに前肢の交差と組み合わせた過伸展は、ジストニア様として採点される。後肢のジストニアのような動きは、引き込みと食いしばり、ならびに持続的な過伸展を意味し、ゼロから3ポイントにスコア付けされる。
記録された時間の80%以上のトランカル歪みが追加点で採点されます。後肢のクラスピングは運動障害に対する非特異的徴候であり、採点してはならない。このグラフは、ジストニア評価尺度の結果を示す。
ワバン透過型ストレスマウスは、非ストレスワバン透過群および動物よりも72時間の観察期間にわたってジストニア様の動きを有意に多く提示する。この画像は、尾部懸濁液試験の結果を示し、ジストニア評価尺度と同様の結果を示しています。なお、各時点の各動物の合計スコアから平均の結果を得る。
このビデオを見た後、あなたは立体的に複数の脳カニューレを移植する方法と皮下浸透性ポンプを移植する方法をよく理解しているはずです。この方法の主な利点は、反復的でストレスの多い注射を避けることができ、そうでなければシステム全体の副作用を持つであろうワバンのような基質が特定の脳構造に直接送達できることである。
