Name: genetic variant detection in the calr gene using high resolution melting analysis
Uploaded: 2020-08-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا جميع الخبراء الأكاديميين والموظفين في مختبر أمراض الدم المتخصص، قسم أمراض الدم، شعبة الطب الباطني، المركز الطبي الجامعي ليوبليانا.

وقد وافقت لجنة الأخلاقيات الطبية في جمهورية سلوفينيا على الدراسة. وكانت جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي.
1. الفلورسينس القائم على الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) وتحليل ما بعد qPCR من قبل إدارة الموارد البشرية
<ol><li>Resuspend التمهيديات المدرجة في جدول المواد إلى 100 ميكر?...

<ol>
	<li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2.">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).</li><li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).</li><li>Vainchenker, W., Kralovics, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+and+molecular+pathophysiology+of+classical+myeloproliferative+neoplasms.">Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. 129, 667-679 (2017).</li><li>Pietra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+clinical+effects+of+different+mutation+subtypes+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms.">Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 30, 431-438 (2016).</li><li>Lim, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+CALR+exon+9+mutations+using+high-resolution+melting+analysis.">Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis.</a> Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).</li><li>Lay, M. J., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+fluorescence+genotyping+of+factor+V+leiden+during+rapid-cycle+PCR.">Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR.</a> Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).</li><li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+(HRMA)+-+More+than+just+sequence+variant+screening.">High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening.</a> Human Mutation. 30, 860-866 (2009).</li><li>Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+revision+and+proposed+changes+of+the+WHO+diagnostic+criteria+for+polycythemia+vera,+essential+thrombocythemia+and+primary+myelofibrosis.">Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis.</a> Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).</li><li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis.">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).</li><li>Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CALR+mutations+in+a+cohort+of+JAK2+V617F+negative+patients+with+suspected+myeloproliferative+neoplasms.">CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms.</a> Scientific Reports. 9, 19838 (2019).</li><li>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).</li><li>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).</li><li>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).</li><li>Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+melting+analysis+for+simple+and+efficient+molecular+diagnostics.">High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics.</a> Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).</li><li>Gonzalez-Bosquet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+somatic+mutations+by+high-resolution+DNA+melting+(HRM)+analysis+in+multiple+cancers.">Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers.</a> PLoS One. 6, 14522 (2011).</li><li>Van Der Stoep, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+guidelines+for+high-resolution+melting+curve+(HRM)+analysis:+An+interlaboratory+validation+of+BRCA1+mutation+scanning+using+the+96-well+LightScanner.">Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner.</a> Human Mutation. 30, 899-909 (2009).</li><li>Singdong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+Prognosis+Significance+of+JAK2+(V617F),+MPL,+and+CALR+Mutations+in+Philadelphia-Negative+Myeloproliferative+Neoplasms.">Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).</li><li>Erali, M., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+analysis+for+gene+scanning.">High resolution melting analysis for gene scanning.</a> Methods. 50, 250-261 (2010).</li><li>Bilbao-Sieyro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Melting+Analysis:+A+Rapid+and+Accurate+Method+to+Detect+CALR+Mutations.">High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations.</a> PLoS One. 9, 103511 (2014).</li><li>S&#322;omka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+(HRM)+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies.">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+common+DNA+concentration+measurement+methods.">Comparison of three common DNA concentration measurement methods.</a> Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).</li><li>Voytas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis.">Agarose Gel Electrophoresis.</a> Current Protocols in Immunology. 2, (1992).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Endonuclease+R&#183;EcoRI+Fragments+of+DNA+from+Lambdoid+Bacteriophages+and+Other+Viruses+by+Agarose-Gel+Electrophoresis.">Analysis of Endonuclease R&#183;EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis.</a> Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).</li></ol>

ذوبان عالية الدقة من الحمض النووي هو حل بسيط ل genotyping والمسح الجيني المتغير14. يعتمد ذلك على اختلافات التسلسل التي تؤدي إلى الترودوبليكس التي تغير شكل منحنى الذوبان. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد لمجموعة معينة من المرضى ال?...

تم التعرف على المتغيرات الوراثية الجسدية في جين السعرات الحرارية(CALR)في عام 2013 في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية (MPN) مثل تجلط الدم الأساسي والتليف النقوي الأولي1،2. ومنذ ذلك الحين، تم اكتشاف أكثر من 50 متغيرا جينيا في جين CALR، مما أدى إلى تحول إطاري +1 (−1+2)3. المتغيران الجينيان الأكثر شيوعا في CALR هما حذف 52 bp (NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52، p.(Leu367Thrfs*46))، وتسمى أيضا طفرة من النوع 1، وإدخال 5 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC، p.(Lys385Asnfs*47))، وتسمى أيضا طفرة النوع 2. يمثل هذان المتغيران الجينيان 80٪ من جميع المتغيرات الجينية CALR. وقد صنفت الأخرى على أنها نوع 1-مثل أو نوع 2-مثل استخدام خوارزميات على أساس الحفاظ على الحلزون α قريبة من نوع البرية CALR4. هنا، نقدم واحدة من الطرق الحساسة للغاية والسريعة للكشف عن المتغير الجيني CALR، وطريقة تحليل ذوبان عالية الدقة (HRM). تمكن هذه الطريقة من الكشف السريع عن المتغيرات الجينية من النوع 1 والنوع 2 ، والتي تمثل غالبية طفرات CALR 5. وقدم إدارة الموارد البشرية في تركيبة مع الوقت الحقيقي »تفاعل البوليميراز المتسلسل« (qPCR) في عام 1997 كأداة للكشف عن طفرة في عامل V لايدن6. بالمقارنة مع تسلسل سانجر الذي يمثل تقنية المعيار الذهبي ، فإن إدارة الموارد البشرية هي طريقة أكثر حساسية وأقل تحديدا5. طريقة إدارة الموارد البشرية هي طريقة فحص جيدة تمكن من التحليل السريع لعدد كبير من العينات مع فائدة كبيرة من حيث التكلفة5. وهو أسلوب PCR بسيطة يؤديها في وجود صبغة الفلورسنت ولا تتطلب مهارات محددة. فائدة أخرى هي أن الإجراء نفسه لا يضر أو يدمر العينة التي تم تحليلها التي تسمح لنا بإعادة استخدام العينة لتسلسل الكهربائي أو سانجر بعد إجراء إدارة الموارد البشرية7. العيب الوحيد هو أنه من الصعب في بعض الأحيان تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك، لا تكتشف إدارة الموارد البشرية الطفرة الدقيقة في المرضى الذين يعانون من طفرات غير من النوع 1 أو النوع2 8. في هؤلاء المرضى، ينبغي تنفيذ تسلسل سانجر(الشكل 1).
وتستند إدارة الموارد البشرية على تضخيم منطقة الحمض النووي المحددة في وجود صبغة فلورية الحمض النووي المشبعة ، والتي يتم دمجها في الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA). تنبعث من الصبغة الفلورية ضوء عند دمجها في dsDNA. بعد زيادة تدريجية في درجة الحرارة، dsDNA ينهار إلى الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل، والتي يمكن الكشف عنها على منحنى ذوبان كانخفاض مفاجئ في كثافة الفلورية. يعتمد شكل منحنى الذوبان على تسلسل الحمض النووي الذي يستخدم للكشف عن الطفرة. تتم مقارنة منحنيات ذوبان العينات بمنحنيات ذوبان الطفرات المعروفة أو CALR البرية. تمثل منحنيات الذوبان المتميزة طفرة مختلفة غير من النوع 1 أو النوع 29.
خوارزمية الكشف عن المتغير الجيني الجسدي في الجين CALR بواسطة إدارة الموارد البشرية، أجاروز هلام electrophoresis وطريقة التسلسل(الشكل 1)تم استخدامها والتحقق من صحتها في الدراسة بأثر رجعي نشرت قبل10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-Gel EX 4% Agarose</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>G401004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuorometer 3.0 QUBIT</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>G6465EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeltDoctor HRM MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4415440</td>
			<td>Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>NG-1045</td>
			<td>Gel documentation systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CALRex9 Forward</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: 5&#39;GGCAAGGCCCTGAGGTGT&#39;3 (High-Purity, Salt-Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CALRex9 Reverse</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: 5&#39;GGCCTCAGTCCAGCCCTG&#39;3 (High-Purity, Salt-Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT dsDNA HS assay</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trackit 100bp DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10488058</td>
			<td>Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4453534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water nuclease free</td>
			<td>VWR, Life Science</td>
			<td>436912C</td>
			<td>RNase, DNase and Protease free water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic variant detection in the calr gene using high resolution melting analysis

تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو وسيلة قوية لل genotyping والمسح الجيني الاختلاف. تعتمد معظم تطبيقات إدارة الموارد البشرية على تشبع أصباغ الحمض النووي التي تكشف عن اختلافات التسلسل ، واللاتيرودوبلس التي تغير شكل منحنى الذوبان. وهناك حاجة إلى دقة ممتازة للصك وبرامج خاصة لتحليل البيانات لتحديد الاختلافات الصغيرة في منحنى الذوبان التي تحدد متغيرا أو نمطا جينيا. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد للمرضى الذين يعانون من مرض معين ، وخاصة السرطان وفي جين CALR في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية النقوية السالبة للكروموسوم في فيلادلفيا. يمكن الكشف عن التغيرات النيوكليوتيدات واحد، الإدراج و / أو الحذف (indels) في الجين من الفائدة من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية. ويستند تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية في الغالب على الضوابط المستخدمة في فحص إدارة الموارد البشرية QPCR. ومع ذلك ، مع زيادة طول المنتج ، يصبح الفرق بين منحنيات البرية والهتيروزيجوتي أصغر ، ونوع المتغير الجيني أكثر صعوبة في تحديده. لذلك ، حيث indels هي البديل الجيني السائد المتوقع في جين الاهتمام ، يمكن استخدام طريقة إضافية مثل إلكتروفورسيس هلام الآغاروز لتوضيح نتيجة إدارة الموارد البشرية. في بعض الحالات، يجب إعادة فحص/إعادة تشخيص نتيجة غير حاسمة من خلال تسلسل سانجر القياسي. في هذه الدراسة بأثر رجعي، طبقنا هذه الطريقة على JAK2 V617F-المرضى الذين يعانون من MPN.

إن منطقة الحمض النووي التي تم تضخيمها بنجاح مع زيادة هائلة في الفلورسينس تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35 والقيم الضيقة للغاية لدورة القياس الكمي (Cq) في جميع العينات والضوابط المكررة(الشكل 2)هي شرط أساسي لتحديد المتغيرات الجينية الموثوق بها من خلال تحليل إدارة الموارد البش...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis at JoVE.com

Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو حل حساس وسريع للكشف عن المتغير الجيني. ذلك يعتمد على الاختلافات التسلسل التي تؤدي إلى تغيير شكل heteroduplexes منحنى ذوبان. من خلال تمشيط HRM و agarose هلام الكهربائي، يمكن تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية مثل indels.

الكشف الجيني المتغير في الجين CALR باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة

High resolution melting analysis (HRM) is a powerful method for genotyping and genetic variation scanning. Most HRM applications depend on saturating DNA ...

This method accurately defines calreticulin mutations in patients with suspected hematologic condition, especially where other diagnostic options are limited or there is an overlap with non-hematologic conditions. The main advantage of the high resolution mirror technique is detecting the common somatic genetic variants in the hotspot region of the calreticulin gene at the acceptable limit of detection and affordable cost. This technique enables rapid and noninvasive diagnosis of myeloproliferative disorders, especially essential thrombocythemia and primary myelofibrosis.Currently it has no effect on the choice of therapy in these patients. However, this may change in the future. Begin by preparing the qPCR HRM master mix as described in the text manuscript, making enough for three replicates of each DNA sample and control.Mix the reaction contents by gently tapping and inverting the tube and vortexing for two to three seconds, then briefly spin the tube to collect the scattered droplets. Transfer 19 microliters of the qPCR HRM master mix to each well of the 96 Well Optical Reaction Plate. Pipette one microliter of the negative controls, positive controls and samples into the appropriate wells of the plate for the no template control or NTC at one microliter of sterile RNAs and DNA's free water used for preparing the qPCR HRM master mix instead of DNA.Seal the reaction plate firmly with the optical adhesive film to prevent evaporation during the run. Then spin it at 780 times G at room temperature for one minute. Check that the liquid is at the bottom of the wells in the reaction plate and run the assay.Assign the controls and samples to the appropriate wells in the instrument system software and change the default instrument amplification protocol. Program the instrument as described in the text manuscript to perform the dissociation analysis immediately after qPCR. when the run end review and verify the amplification plot.In the experiment menu of the instrument system software select the amplification plot option. If no data are displayed, click the green analyze button. In the Amplification Plot tab from the plot type dropdown menu, select the plot that displays the amplification data as the fluorescence readings, normalized to the fluorescence from the passive reference as a function of cycle number, In the plot color dropdown menu, select sample.From the graph type dropdown menu, select the linear amplification graph type, verify that the baseline start and end cycle is set correctly. The end cycle should be set a few cycles before the cycle number where a significant fluorescent signal is detected. From the graph type dropdown menu, select the log 10 amplification graph type show the threshold line on the graph by selecting the threshold option and adjust the threshold.The threshold line should cross the exponential phase at the qPCR curves. Verify that all sample and positive control Wells have normal amplification curves and that there is no amplification in the NTC Wells. A normal amplification plot shows an exponential increase in florescence that exceeds the threshold between cycles 15 and 35.In the derivative melt curves review the pre and post melt regions or temperature lines. The pre and post melt regions should be within a flat area where there are no large peaks or slopes in the fluorescent levels. If needed set the start and stop of the pre and post melt temperature lines, approximately 0.5 degrees Celsius apart from each other.Restart the analysis if the parameters are adjusted by clicking on the analyze button. In the plot settings tab of the difference pot tab, choose one of the wild type control replicates as the reference DNA and restart the analysis by clicking on the analyze button. In the aligned Melt curves tab, confirm that all positive controls have the correct genotype and that the NTC failed to amplify.From the well table, select a control well to highlight the corresponding melt curve in the analysis plots and confirm that the color of the line corresponds to the correct genotype. In the aligned melt curves tab carefully review the plot displays for the unknown samples and compare them to the plot displays for controls. Select the Wells containing the unknown sample replicates and align the melt curves with the controls in an ordered sequence by selecting the wells containing controls one by one.Analyze the result for the unknown sample in the Difference Plot tab to verify that the results obtained are consistent. Select the wells containing the unknown sample replicates and align the melt curves with the controls in an ordered sequence, selecting the Wells containing controls one by one. Run qPCR HRM products on a 4%agarose precast gel containing a fluorescent nucleic acid strain.Run only one positive negative NTC and sample qPCR HRM replicates. Remove the precast gel and the cassette from the package then remove the comb and insert the gel into the apparatus according to the manufacturer's instructions. Dilute a 10 microliter sample to 20 microliters with sterile RNA and DNA free water and load each well with 20 microliters of the diluted sample.Dilute three microliters of DNA size standard solution to 20 microliters and load it into the marker well. Fill any empty wells with 20 microliters of sterile RNA and DNA's free water. Immediately select the program according to the percentage of the gel being run and set the runtime on the apparatus to 20 minutes.Start the electrophoresis within one minute of loading the samples. When the electrophoresis is completed, visualize the DNA and the gel by using blue light or UV transillumination. And successfully amplified DNA region of interest with an exponential increase in fluorescents that exceeds the threshold between cycles 15 and 35 and very narrow values of the cycle of quantification in all replicates and controls is a prerequisite for the reliable identification of genetic variance by high resolution melting analysis.HRM analysis is performed immediately after qPCR, the active melt regions of the samples, the controls and the NTC are used to create their aligned melt curve plots. Correctly set pre and post melt regions are important for properly visualizing and identifying genetic variance in the samples. Aligned melt curves and different pots are shown here.The unknown samples are tightly aligned with one of the positive controls. Incorrectly set pre and post melt regions or temperature lines result in aligned melt curves and different plots where correct identification of the genetic variance is more difficult. The genetic variant in the sample can be identified by comparing the band pattern of the sample to the controls.And by combining the HRM and agarose gel electrophoresis. Correct genetic variant identification can only be done for the samples that contain the same genetic variant as one of the controls used in the HRM assay. Samples containing rare calreticulin genetic variants differ in the HRM result and electrophoresis band pattern.When attempting this protocol, it is important to carefully compare the aligned melt curve plot displays of the known and control samples.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

عالية الدقة ذوبان ير ل تكمل مستقبلات 1 طول تعدد الأشكال التنميط الجيني: أداة مبتكرة لمرض الزهايمر الجينات تقييم القابلية

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

مروج التقاط مرحبا c: عالية الاستبانة، وعلى نطاق الجينوم التنميط التفاعلات المروج

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

مقارنة عالية الاستبانة للترددات الاقتران البكتيري

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

تحديد احتمال الإمراضية متغير باستخدام تحليل الإشارات إلى الضجيج مستوى الأحماض الأمينية للتنوع الوراثي

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحليل بدقه وكفاءه الناسخ ميكرورنا في النباتات

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

تحديد الطفرات من خلال ذوبان عالية الدقة في عدد السكان من الأرز الحرث

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

تحويل جذر الطماطم متبوعاً بالتلقيح مع Ralstonia Solanacearum للتحليل الوراثي المباشر لمرض الذبول البكتيري

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...