Name: preparing and injecting embryos of culex mosquitoes to generate null mutations using crispr/cas9
Uploaded: 2020-09-10T15:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

우리는 데이비드 O'Brochta 박사와 곤충 유전 기술 조정 연구 네트워크의 모든 구성원들이 유전 기술의 구현에 대해 우리와 다른 사람들에게 제공하는 도움과 훈련을 주셔서 감사합니다. 우리는 특히 컬렉스 배아를 주입하고 부화할 수 있도록 미세 조작 프로토콜을 최적화한 찬나 알루비헤어에게 감사드립니다. 또한 Meuti 연구소에서 일하는 학부 생인 데반테 시몬스와 조셉 우르소(Joseph Urso)와 트랜스제닉 모기를 돌보고 선별하는 데 도움을 준 데반테 시몬스와 조셉 우르소, ITF의 조라 엘름카미(Zora Elmkami)가 모기를 사육하고 주사를 준비하는 데 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 MEM에 제공 OSU에 감염증 연구소에서 학제 간 씨앗 보조금에 의해 지원되었다.

대부분의 연구 기관에서, 승인된 생물안전 프로토콜은 유전자 변형 된 유기체가 실험실 시설에서 탈출하거나 제거되지 않도록 트랜스 제닉 곤충이 생성되거나 유지되기 전에 제자리에 있어야합니다. 추가 정부 규정도 적용될 수 있습니다. 이러한 특성의 프로젝트를 시작하기 전에 모든 기관 정책과 절차를 확인하여 필요한 문서와 승인이 결정됩니다.
1. gRNA 설계 및 사출...

<ol>
	<li>Hamer, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+(Diptera:+Culicidae):+a+bridge+vector+of+West+Nile+virus+to+humans.">Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).</li><li>Bailey, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+St.+Louis+encephalitis+virus+from+overwintering+Culex+pipiens+mosquitoes.">Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes.</a> Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).</li><li>Sabry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+realistic+index+of+experimental+transmission+efficiency+for+Bancroftian+filariasis.">A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis.</a> The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).</li><li>Cancrini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+albopictus+and+Culex+pipiens+implicated+as+natural+vectors+of+Dirofilaria+repens+in+central+Italy.">Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy.</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).</li><li>Wilton, D. P., Smith, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+diapause+in+three+geographic+strains+of+Culex+pipiens+(Diptera:+Culicidae).">Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).</li><li>Mattingly, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culex+pipiens+complex.">The Culex pipiens complex.</a> Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).</li><li>Eldridge, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+temperature+and+photoperiod+on+blood-feeding+and+ovarian+development+in+mosquitoes+of+the+Culex+pipiens+complex.">The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).</li><li>Spielman, A., Wong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+ovarian+diapause+in+Culex+pipiens.">Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens.</a> Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).</li><li>Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. 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R., Wang, X., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).</li><li>Anderson, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilia+sericata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae).">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae).</a> Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li><li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li><li>Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/Cas9+plasmids+for+rapid+and+versatile+genome+editing+in+Drosophila.">Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+genome+editing+using+RNA-guided+nucleases.">Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN/CRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti.">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li></ol>

이 프로토콜은 Culex 모기의 게놈으로 특정 돌연변이를 소개하는 방법을 제시하고 또한 그밖 모기의 게놈을 편집하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 주입 물질을 준비하는 방법뿐만 아니라 모기가 계란을 낳도록 유도하는 방법과 그 계란을 준비하고 주입하는 방법에 대한 자세한 비디오 개요를 제공한다는 점에서 중요합니다. 우리는 또한 개별 뗏목에 계란을 낳고 따라서 원하?...

컬렉스 모기는 전 세계의 온대 및 열대 지역에 분포되어 있으며 웨스트 나일 바이러스1,세인트 루이스 뇌염2뿐만 아니라 개 심장벌레3 및 elephantiasis4를일으키는 필리알 선충을 포함한 여러 치명적인 바이러스를 전송합니다. Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens 및 Cx. pipiens 성추행을포함하는 Culex pipiens 복합체의 구성원은 생물학의 많은 양상에서 눈에 띄는 변화를 보여줍니다. 예를 들어, Cx. quinquefasciatus 및 Cx. pipiens 성추행은 겨울휴면5,6, Cx. pipiens 피피엔스는 짧은 일7,8에대한 응답으로 강력한 계절 반응을 표시하고 diapause를 입력 할 수 없습니다. 또한 Cx. pipiens 성추행은 더 인류애호가경향이 있는 반면 Cx. pipiens와 Cx. quinquefasciatus는 더 많은 동물 애호가6. 그러나 미국과 전 세계 많은 다른 장소에 걸쳐, Cx의 하이브리드로 질병 전염에 강한 영향을 미치는 이 종간 교배. pipiens pipiens 와 Cx. pipiens 성추행은 기회 피더이며 조류와 인간 을 모두 물린것입니다 9,따라서 웨스트 나일 바이러스에 대한 다리 벡터역할을. Culex 모기의 생물학의 이것과 그밖 매혹적인 양상을 공부하는 것은, 부분적으로, Culex 모기는 정지및 건조 저항하는 계란10을 생성하는 Aedes 모기 보다는 실험실에서 서있기 약간 더 어렵기 때문에 및 기능적인 분자 공구가 Culex 종을 위해 잘 개발되지 않기 때문에 방해되었습니다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집은남부 집 모기, 컬렉스 퀸케파시아투스14,15,16을포함하여 몇 가지 중요한 모기 종11,12,13의생물학을 평가하는 데 사용되는 강력한 기술이다. 제니퍼 두나와 엠마뉴엘 샤펜티에가 개발한 이 기술은 세균 유래, CRISPR 관련 엔도니클로스(Cas 단백질; Van der Oost 외17)에의한 바이러스에 대한 자연적인 세균 방어를 이용합니다. 동물 배아에 주입할 때, Cas9 단백질은 적당한 가이드 RNA와 조합하여 게놈 내의 이중 좌초 된 휴식을 생성할 수 있습니다. 이것은 가장 빈번하게 게놈의 특정 지구에 엔도누엔리스 활성을 지시하는 가이드 RNA로 복합되는 Cas9 단백질을 사용하여 행해집니다. Cas9 단백질이 사이트별 이중 좌초 휴식을 만든 후, 세포 기계는 두 가지 메커니즘 중 하나를 사용하여 휴식을 복구하려고합니다. 첫 번째는 오류가 발생하기 쉽고 종종 비기능성 단백질을 초래할 수 있는 게놈의 아웃프레임 삽입 및 삭제를 생성하는 비동상종 결합(NHEJ)을 통해 두 끝을 결집시켜 녹아웃 돌연변이를 생성합니다. 또는 셀룰러 기계는 유사한 시퀀스를 찾아 파손을 올바르게 복구하여 동종 학 지향 수리(HDR)를 사용할 수 있습니다. 유사한 서열은 유기체 내의 제2 염색체에 의해 제공될 수 있다(리뷰18참조). 그러나, 수리된 서열이 원래 서열과 정확히 일치하면 Cas9 단백질은 DNA를 다시 절단할 수 있을 것이다. 대안적으로, 연구원은 또한 대체 수리 순서를 가진 표적 서열의 절단 사이트의 양쪽에 동종 서열을 포함하는 기증자 플라스미드를 포함할 수 있습니다 - 종종 형광 마커 단백질, 원래 유전자의 변형 된 버전, 또는 기타 수정 - 게놈에 복사 및 삽입 할 수 있습니다, 또는 "노크-인."
타이밍은 배아를 주입 할 때 중요하며, 특히 CRISPR / Cas9 게놈 편집을 사용하여 곤충의 돌연변이를 만들 때 특히 그렇습니다. 이는 Cas9 단백질과 gRNA가 배아가 동기화 상태에 있을 때만, 세포막이 형성되기 전에, 그리고 다중 핵이 배아 내에서 접근할 수 있을 때만 돌연변이를 생성하는 가장 큰 능력을 갖기 때문이다. 모기의 경우, 핵은 온도19에따라 oviposition 후 주변 ~ 2-4 시간 동안 도달하므로 성공적인 미세 주입이 이 시간 전에 발생해야합니다. 추가적으로, Cas9 단백질은 주입에서 유래된 개별이 세포의 모자이크를 포함할 것이라는 점을, 몇몇은 원하는 돌연변이를 가진, 그리고 그 외는 접근할 수 있는 어떤 핵 DNA든지 자를 것입니다. 이러한 돌연변이가 성공적으로 상속되기 위해서는 Cas9 단백질이 미래의 계란과 정자를 초래할 생식선에 있는 DNA를 잘라야합니다. 생식선에서 돌연변이가 생성되도록 하기 위해 곤충 생식선의 선조인 배아 내극 세포의 위치에 가까운 모든 물질을 주입하는 것이 가장 좋습니다. 극 세포는 Culex 배아20의후방 끝 근처에 위치한다. 배아를 주입하는 것 외에도 원하는 돌연변이를 감지하기 위해 자손을 횡단하고 선별하기 위한 신중한 계획을 개발하는 것이 필수적입니다.
이 프로토콜은 gRNA를 생성하고 주입 믹스를 준비하기 위해 Cas9 단백질로 복합하는 방법뿐만 아니라, 쿨렉스 피피엔스의 여성 모기가 계란을 낳는 방법과 CRISPR / Cas9 매개 게놈 편집을 위해 그 계란을 준비하고 주입하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 원하는 돌연변이가 얻어졌다는 것을 확인하기 위하여 주입된 태아 및 그들의 자손을 후면, 교차 및 스크린하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 컬렉스 피피엔스의벅아이 균주에서 관심 있는 유전자, 사이클에대한 null 돌연변이를 생성했습니다. 이 균주는 원래 콜럼버스, 오하이오에서 필드 수집 모기에서 2013 년에 설립되었으며 Meuti 실험실에 의해 유지됩니다. 이 프로토콜은 쿨렉스 모기뿐만 아니라 다른 모기 종에서 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 요구하는 추가 연구에 사용될 수 있으며, 더 일반적으로 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 모든 곤충 종에 사용하는 것과 관련이 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:622px;" width="623">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Artificial Membrane Feeder</td>
			<td style="width:121px;">Hemotek</td>
			<td style="width:119px;">SP5W1-3</td>
			<td style="width:167px;">Company location: Blackburn, UK</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18330019</td>
			<td style="width:167px;">Company location: Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter</td>
			<td style="width:121px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-6</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Sarasota, FL, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">BV10 Needle Beveler</td>
			<td style="width:121px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BV-10-B</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Nobato, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Whatman Circular filter paper (12.5 cm)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA1001125</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Conical tube (50 mL)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fisherbrand course filter paper with fast flow rate</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-800</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Cover glass (24 x 40 mm)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-311-20</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Dental dam</td>
			<td style="width:121px;">Henry Schein Inc</td>
			<td style="width:119px;">1010171</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Melville, NY USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Scotch double-sided tape</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0879005</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">FemtoJet 4i microinjector</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5252000021</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Glass vial (2 dram)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">033401C</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898-50ML</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">P-2000 Laser Needle Puller</td>
			<td style="width:121px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-2000/G</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Nobato, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-998-944</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">PC-100 Weighted Needle Puller</td>
			<td style="width:121px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">PC-100</td>
			<td style="width:167px;">This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Phire Direct PCR Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F140WH</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Kodak Photo-Flo (1%)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-268-05</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter</td>
			<td style="width:121px;">Capillary Tube Supplies Limited</td>
			<td style="width:119px;">QGCT 1.0</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Cornwall, UK</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Guide-it&#8482; sgRNA Screening Kit</td>
			<td style="width:121px;">Takara, Bio USA</td>
			<td style="width:119px;">632639</td>
			<td style="width:167px;">This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Small petri dishes (35X10 mm)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-190-0273</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Sodium citrate chicken blood</td>
			<td style="width:121px;">Lampire biologicals</td>
			<td style="width:119px;">7201406</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Everett, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875711A</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Tegaderm</td>
			<td style="width:121px;">Henry Schein Inc.</td>
			<td style="width:119px;">7771180</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Melville, NY USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Tropical fish food</td>
			<td style="width:121px;">Tetramin</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-927-826</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Whatman filter paper, 4.25 cm</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1001-042</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing and injecting embryos of culex mosquitoes to generate null mutations using crispr/cas9

컬렉스 모기는 웨스트 나일 바이러스와 개 심장벌레와 코끼리와 같은 filarial 선충에 기인한 질병을 포함하여 인간과 동물의 건강에 부정적인 영향을 미치는 몇몇 질병의 중요한 벡터입니다. 최근에는 제네라 아노필스와 에데스에속하는 모기를 포함하여 여러 곤충 종의 갓 배치된 배아에 가이드 RNA(gRNA)로 복합된 Cas9 단백질을 주입하여 현장 지향 돌연변이를 유도하는 데 사용되어 왔다. 컬렉스 모기를 조작하고 주입하는 것은 이 모기가 다른 모기 종처럼 뗏목에서 알을 똑바로 세우기 때문에 약간 더 어렵습니다. 여기에서 우리는 gRNA를 디자인하는 방법, Cas9 단백질로 그(것)들을 복잡하게 하고, Culex pipiens의 여성 모기를 계란을 낳기 위하여 유도하고, Cas9/gRNA를 가진 미세 주입을 위한 새로 놓인 태아를 준비하고 주입하는 방법을 기술합니다. 우리는 또한 원하는 돌연변이를 위해 주입된 모기를 후방및 스크린하는 방법을 설명합니다. 대표적인 결과는 이 기술이 Culex 모기의 게놈에 있는 사이트 지시돌연변이를 유도하기 위하여 이용될 수 있고, 약간의 수정으로, 그밖 모기 종에 있는 널 돌연변이를 생성하는 것을 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.

설명된 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 Cx. pipiens의배아를 주입할 수 있었고, 주입된 태아 중 생존율이 높은 것을 관찰하였다(~55%, 도 1). 이전 시험은 달걀 여포의 전방이 의학 드레싱 스트립에 부착되었기 때문에 생존의 비율이 낮았으며, 모기 유충이 초리온에서 탈출하고 성공적으로 물로 수영하는 것을 막았습니다. 전방 끝이 의료 드레싱의 스트립을 넘어 ...

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Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

This protocol is significant because it provides detailed instructions on how to prepare and inject mosquito embryos for CRISPR-Cas9 genome editing. The main advantages of this micro-injection technique are that it has a high rate of mosquito survival, and allows researchers to determine the function of a gene. This protocol has been specifically tailored to inject mosquitoes that belong to the genus of Culex.These mosquitoes transmit several pathogens, including the viruses that cause West Nile fever and St.Louis encephalitis as well as filarial nematodes, that cause canine heartworm and elephantiasis. Therefore having tools such as CRISPR-Cas9 genome editing, will allow us to better understand and control these important disease factors. Injecting freshly laid insect embryos, and getting a higher rate of survival takes lots of time, practice and patience.Therefore we recommend injecting several embryos with a colored saline solution before injecting expensive materials to generate a mutation. Begin by back-filling the injection needles with the injection mix. Choose a needle filler or gel-loading tip that will fit easily into the back-end of the selected injection needle.Make sure that there is a bit of space between the end of the needle filler and the injection needle. Carefully aspirate, a single small drop of the injection mix into the injection needle near the spot where it begins to taper. Then attach the injection needle to the micro injector.Place the slide containing the embryos onto the stage of the microscope. To open the needle, use a starting injection pressure of approximately 30 Psi and adjust it as necessary to deliver an appropriate volume of injection mix. Under a dissection microscope, position the needle above the mosquito embryo, and carefully use the micromanipulator to lower the needle onto the embryo.Once the needle is barely touching the embryo, quickly move the embryo perpendicular to the long axis of the needle. To determine if the needle was successfully opened, press the injection trigger and see whether any bubbles or injection mix escape from the needle. If not, repeat moving the mosquito embryo against the needle until it is open and the injection mix escapes when the trigger is pressed.Position the first mosquito embryo in the center of view, ensure that it is in focus and place the needle over the first egg. Progressively increase the magnification on the microscope, carefully lowering the needle to keep it just above the first embryo. Proceed until the microscope has reached its highest magnification, and to both the embryo and the needle are in focus.Move the embryo slightly to the left and lower the needle so that it is in the same plane of view as the embryo. Use the microscope stage to gently touch the embryo to the tip of the needle. The narrow posterior end of the mosquito embryo should deflect slightly.Using the microscope stage, move the posterior end of the embryo onto the needle and observe the needle penetrating the chorion of the mosquito egg. The needle should just penetrate the membrane and the approximate location of the pole cells within the embryo. Placing the injection mix in this region, increases the likelihood that mutations will occur and be inherited in the germline.Pull the injection trigger one to three times to shoot injection mix into the embryo. Deliver a small amount of injection mix, just enough that a small clearing in the embryo plasm can be detected. Use the stage to move the embryo to the right, away and off the tip of the needle.If the injection went well, little to no fluid should leak from the embryo. Move the stage down so that the next embryo is positioned in front of the needle. And repeat the injection.If injection mix does not appear to be coming out, or if a large amount of fluid escapes from the embryo after the needle is removed, replace the injection needle and start again. Destroy any uninjected or damaged eggs. After all embryos on the slide have been injected, wash off the Halocarbon oil by applying reverse osmosis water with a squirt bottle.Direct the stream of water onto the top of the glass cover slip above the injected embryos and allow the water to flow down the cover slip, making sure to not direct the stream onto the embryos. Cover the slide with 150 microliters of water and place it on wet filter paper inside of a square Petri dish. Incubate the Petri dish in an environmental chamber, set to 25 to 27 degrees Celsius and 70 to 80%relative humidity with a long-day photoperiod.This protocol was used to successfully inject embryos of the Northern house mosquito, Culex pipiens ensuring that the anterior end of the mosquito embryo extends beyond the strip of medical dressing, greatly increased larval survival and results in high-quality offspring that are capable of developing to adulthood and reproducing. Sequencing revealed, that approximately 10%of the screened mosquitoes showed a small insertion or deletion near the Cas9 cut-site of the first guide RNA, suggesting that the pole cells were successfully targeted during micro-injections. The F1 individuals successfully mated and produced viable offspring, some of which also contained the mutation.When micro-injecting insect embryos, most people struggle with initially opening the needle and moving the embryo onto the needle. Remember that developing these skills takes time and practice. This protocol can be modified or adapted to inject the embryos of other mosquitoes or even other insects species.Beyond using this protocol to knock-out genes with targeted CRISPR-Cas9 genome editing, the same techniques can be used to inject plasmids or transposons to either knock-in genes or generate random mutations. My lab is currently using this technique to better understand how mosquitoes measure daily and regulate their seasonal responses. However, how us researchers are using CRISPR-Cas9 genome editing to better understand the biology of several organisms.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

의 사출. stephensi의 태아는 말라리아 방지 모기를 생성하는

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

연구

생물학

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

수확 및 준비 Drosophila</emElectrophysiological 녹화 및 기타 수속을위한> 태아

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-β 매개 내피- 중간엽 전환(EndMT)과 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 EndMT 이펙터의 기능평가

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

CRISPR/Cas9 기술을 이용한 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이 구축

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...