Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يعترفوا بـ "شياوفي تشن" لتوفيرها لفلورات الأرز الصغيرة والمساعدة في جعل زراعة أنسجة الأرز متوسطة. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (31900611).

1. sgRNA-CAS9 مصنع التعبير عن بناء ناقلات Agrobacterium- بوساطة التحول
<ol><li>استهداف ذكر الجينات العقيمة OsABCG15 في الأرز وفقا للأدب المنشور28.</li>
	<li>تصميم sgRNA للموقع المستهدف يقع بين 106-125 bp في إكسون الثاني من OsABCG15 (الشكل 1).</li>
	<li>استخدام T4 polynucleotide كيناز لتوليف oligos...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

يتم عادةً توليد المسوخ العقيمة الذكرية الاصطناعية بواسطة الطفرات الفيزيائية أو الكيميائية أو البيولوجية العشوائية. على الرغم من أن هذه هي تقنيات قوية، طبيعتها العشوائية فشل في الاستفادة من كمية هائلة من المعرفة الجينومية الحديثة التي لديها القدرة على تقديم تحسينات مصممة خصيصا في تربية ...

ويعتبر الأرز أهم المحاصيل الغذائية، لا سيما في البلدان النامية، وهو يمثل غذاء أساسيا لأكثر من نصف سكان العالم. وعموما، فإن الطلب على حبوب الأرز آخذ في الازدياد ومن المتوقع أن يزداد بنسبة 50 في المائة بحلول عام 2030 و 100 في المائة بحلول عام 20501،2. ويتعين أن تستفيد التحسينات المستقبلية في غلة الأرز من الموارد الجزيئية والجينية المتنوعة التي تجعل من الأرز نموذجاً ممتازاً لبحوث النباتات أحادية الكولدون. وتشمل هذه نظام التحول كفاءة ، والخريطة الجزيئية المتقدمة ، وقاعدة بيانات متاحة للجمهور من علامات تسلسل التعبير ، والتي تم إنشاؤها على مدى سنوات عديدة3،4. استراتيجية واحدة لتحسين غلة المحاصيل هي إنتاج البذور الهجين5، وهو عنصر مركزي منها هو القدرة على التلاعب خصوبة الذكور. يمكن أن يساعد فهم التحكم الجزيئي في خصوبة الذكور في محاصيل الحبوب على ترجمة المعرفة الرئيسية إلى تقنيات عملية لتحسين إنتاج البذور الهجينة وتعزيز إنتاجية المحاصيل6،7.
التحول الوراثي هو أداة رئيسية للبحث الأساسي والزراعة التجارية لأنه يتيح إدخال الجينات الأجنبية أو التلاعب بالجينات الذاتية في نباتات المحاصيل، ويؤدي إلى توليد خطوط معدلة وراثيا. ويمكن أن يساعد بروتوكول التحويل المناسب على تسريع الدراسات البيولوجية الوراثية والجزيئية من أجل الفهم الأساسي للتنظيم الجيني8. في البكتيريا, يحدث التحول الوراثي بشكل طبيعي; ومع ذلك، في النباتات، يتم تنفيذها اصطناعيا باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية9،10. Agrobacterium tumefaciens هي بكتيريا تحملها التربة، الغرام السلبية التي تسبب مرض المرارة التاج في النباتات عن طريق نقل T-DNA، وهي منطقة من بيلازمد تي، إلى الخلية النباتية عن طريق نظام إفراز نوع الرابع11،12. في النباتات، A. tumefaciens-يتوسط التحول يعتبر وسيلة واسعة النطاق لتعديل الجينات لأنه يؤدي إلى تكامل عدد نسخة مستقرة ومنخفضة من T-DNA في الجينوم المضيف13. تم توليد الأرز المحور وراثيا لأول مرة من خلال تحويل الجينات الزراعيةبوساطة في منتصف 1990s في جابونيكا cultivar14. باستخدام هذا البروتوكول، تم الحصول على العديد من الخطوط المعدلة وراثيا في غضون فترة 4 أشهر مع كفاءة التحول من 10٪ -30٪. وأشارت الدراسة إلى أن هناك خطوتين حاسمتين للتحول الناجح: الأولى هي تحريض الكولوس الجنيني من البذور الناضجة والأخرى هي إضافة الأسيتوسيرينجون، وهو مركب فينولي، إلى الثقافة البكتيرية أثناء الزراعة المشتركة، مما يسمح بكفاءة تحويل أعلى في النباتات14،15. وقد استخدم هذا البروتوكول على نطاق واسع مع تعديلات طفيفة في japonica16،17،18،19 ، فضلا عن أصناف أخرى مثل indica20،21،22،23 وjaponicaالاستوائية24،25. في الواقع، أكثر من 80٪ من المقالات التي تصف تحويل الأرز استخدام Agrobacterium-بوساطة تحويل الجينات كأداة13. حتى الآن، وقد تم تطوير العديد من بروتوكولات التحول الجيني باستخدام بذور الأرز كمادة البداية لالتحريض كالوس16،17،18،19. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل جدا عن ازهار الشباب كما explants لإنتاج كالوس. وعموما، من المهم وضع بروتوكول سريع وفعال لتحويل الجينات وتجديدها من أجل علم الجينوم الوظيفي والدراسات المتعلقة بتحسين المحاصيل.
في السنوات الأخيرة، أدى تقدم تكنولوجيا CRISPR-Cas9 إلى آلية دقيقة لتحرير الجينوم لفهم وظيفة الجينات وتقديم تحسينات هامة زراعيا لتربية النباتات26،27. كما تقدم CRISPR وعدًا كبيرًا بالتلاعب في التنمية الإنجابية للذكور والإنتاج الهجين. في هذه الدراسة، استخدمنا نظام خروج المغلوب الجينات باستخدام تكنولوجيا CRISPR-Cas9 ويقترن ذلك ببروتوكول فعال لتحويل جينات الأرز باستخدام النضحات الصغيرة ككزروع، وبالتالي خلق خطوط عقيمة ذكورية مستقرة لدراسة التنمية الإنجابية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

عقم الذكور هو سمة زراعية هامة لإنتاج البذور الهجينة التي تتميز عادة بعيوب وظيفية في الأعضاء التناسلية للذكور / الأماشعة. التقدم الأخير في تكنولوجيا تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 يسمح بكفاءة تحرير عالية وطفرات خروج المغلوب المنقذة للاوقات من الجينات المرشحة الذاتية في مواقع محددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحول الجيني للأرز بوساطة البكتيريا الزراعيةهو أيضاً طريقة رئيسية لتعديل الجينات، وهو ما تم تبنيه على نطاق واسع من قبل العديد من المختبرات العامة والخاصة. في هذه الدراسة، طبقنا CRISPR-Cas9 أدوات تحرير الجينوم ونجحنا في توليد ثلاثة خطوط متحولة عقيمة من الذكور عن طريق تحرير الجينوم المستهدف من OsABCG15 في أصناف japonica. استخدمنا طريقة تحويل الأرز المعدلة بوساطة أغروباكتيريومالتي يمكن أن توفر وسائل ممتازة للإحتياج الوراثي لإنتاج البذور الهجين في الأرز. يمكن الحصول على النباتات المعدلة وراثيا في غضون 2-3 أشهر، وتم فحص المحولات homozygous بواسطة genotyping باستخدام تضخيم PCR وتسلسل سانجر. تم تنفيذ توصيف الثيرنيتيبيك الأساسي لخط الهو انسجامزيجوات المعقم من قبل الملاحظة المجهرية للأعضاء التناسلية الذكورية الأرز، تحليل جدوى حبوب اللقاح بواسطة يوديد البوتاسيوم اليود (I2-KI) تلطيخ المقطع المقطع الفرعي شبه رقيقة من الأنثرس النامية.

ثبت هنا هو استخدام تكنولوجيا تحرير الجينات لإنشاء خط عقيم الذكور للبحوث في المستقبل من قبل Agrobacterium- بوساطة التحول الجيني في الأرز. لإنشاء خط الذكور العقيمة من osabcg15،تم استخدام متماوجينسيس كريسبر-CAS9 بوساطة لبناء ناقلات ثنائي. وكان الدافع sgRNA من قبل المروج OsU3، في حين كان الدافع وراء...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

يصف هذا العمل استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 إلى الجينات الذاتية خروج المغلوب OsABCG15 متبوعة ببروتوكول تحويل معدل بوساطة Agrobacteriumلإنتاج خط مستقر معقم للذكور في الأرز.

البكتيريا الزراعية-بوساطة التحول الجيني، وإنتاج تحويل الجينات، وتطبيقها لدراسة التنمية الإنجابية للذكور في الأرز

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

إن النسيلات الصغيرة ككزروع لإنتاج الهال مهمة لإنشاء تحول جيني سريع وفعال وطريقة تجديد للكشف عن وظيفة الجينات وكذلك لتحسين المحاصيل. إن الانحلال الصغير ككزروع لإنتاج الالة مهم لإنشاء تحول جيني سريع وفعال وطريقة تجديد للكشف عن وظيفة الجينات. عرض الفيديو من هذه التقنية سوف تساعد المشاهد على فهم عملية الحفاظ على المواد لإنتاج أن المواءمة التي تريد تحويلها وراثيا دون إضاعة الوقت والجهد.تبدأ بجمع الأرز الصغير infloresences من حقل الأرز أو الدفيئة في مرحلة meiosis، والتأكد من أنها مغطاة مع غدد ورقة. امسح كل إنفليل مع مسحة كحولية بنسبة 70٪ واتركها تجف قبل القطع. جلب فيلنسي إلى مقعد مختبر معقمة وقطعها إلى قطع صغيرة مع مقص معقمة، ثم نقل القطع إلى لوحة بيتري التي تحتوي على وسيط NBD2.احتضان لوحة في الظلام في 26 درجة مئوية لمدة 10 إلى 14 يوما للحث على كالوس. لإجراء التحول، نقل مستعمرة واحدة من لوحة EB بيضاء مع المضادات الحيوية الانتقائية إلى خمسة ملليلتر من وسيط YEB السائل الذي يحتوي على نفس المضادات الحيوية في أنبوب اختبار مخروطي 50 ملليلتر. هز الأنبوب على شاكر مداري في 250 مرة ز و 25 إلى 28 درجة مئوية حتى تنمو البكتيريا إلى OD 600 من 0.5.إضافة ملليلتر واحد من التعليق البكتيري إلى 100 ملليلتر من المتوسط YEB مع نفس المضادات الحيوية الانتقائية في قارورة مخروطية 250 ملليلتر وهز القارورة على شاكر المداري في 250 مرة ز و 28 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. الطرد المركزي في الثقافة في 4، 000 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع البكتيريا. تجاهل supernatant وإعادة فرض بيليه مع AAM كما المتوسطة، ثم تمييع التعليق إلى OD 600 من 0.4.بعد الحضانة، وجمع حوالي 150 صحي ضوء البذينة الصفراء كالي في قارورة معقم 150 ملليلتر. إضافة 50 إلى 75 ملليلتر من تعليق الخلية البكتيرية في قارورة ثم إضافة 10 إلى 25 ملليلتر من AAM الطازجة المتوسطة كما لغمر كالي لمدة 10 إلى 20 دقيقة، تهتز أحيانا. صب التعليق البكتيري من القارورة بعناية وتجفيف calli مع ورقة فلتر معقمة، ثم وضعها على طبق بيتري مع NBD AS المتوسطة وتغطيتها مع ورقة التصفية.احتضان الكاودي في 25 إلى 28 درجة مئوية في الظلام لمدة ثلاثة أيام، والتحقق منها لإفراط في النمو البكتيري. بعد ثلاثة أيام من الزراعة المشتركة، نقل كالي إلى طبق بيتري العقيمة باستخدام ورقة التصفية، ثم الهواء الجافة لهم لمدة ساعتين على مقعد نظيفة. تأكد من عدم الالتزام بالـ calli لورقة التصفية ونقلها إلى وسيط الاختيار الأساسي NBD2.بعد أسبوعين, نقل كالي بالتساوي إلى لوحة جديدة تحتوي على وسيلة اختيار جديدة, ثم نقل كالي إلى المتوسطة MS الطازجة للتمايز وبراعم تبادل لاطلاق النار إلى المتوسط MS مع 10 ملليغرام للتر هيغروميسين لتكاثر أكثر يطلق النار. نقل يطلق النار الجديد إلى نصف المتوسط MS لاستقراء الجذر وثقافتها تحت الضوء في 25 إلى 28 درجة مئوية. وينبغي أن تنتج النباتات المحولة جذور في غضون أسبوعين.لأداء الملاحظة الظاهرية الإنجابية، وإزالة باليا وlemma من الزهور وصورة جميع النوبات تحت مجهر ستيريو. لمراقبة جدوى حبوب اللقاح، واختيار spikelets الأرز ناضجة قبل أنثيس زهرة وإزالة الباليه وlemma لإطلاق سراح الذرات. خذ ستة ذرات ووضعها على شريحة زجاجية.إضافة قطرة واحدة من الماء المقطر، سحق أنثر مع ملاقط لإطلاق حبوب اللقاح، ثم إضافة 2-3 قطرات من محلول اليود وتغطية مع غطاء. مراقبة الشريحة تحت مجهر التكبير منخفضة. حبوب اللقاح السوداء الملوّهة تظهر قدرة أكثر قوة على البقاء في حين أن الحبوب التي لا لون لها أو تلك البني الأصفر المصبغة هي التقزم أو المنحطة.لأداء المجهر المقطع عرضية، واستخدام 0.5٪ toluidine حل الأزرق لطخة الشرائح لمدة 30 دقيقة، ثم شطف لهم بالماء وتجفيفها في غطاء الدخان. مرة واحدة الجافة، وختم الشرائح مع الغراء شجرة محايدة، ووضع بلطف غطاء على الشريحة وتجفيفها في غطاء محرك الدخان، ثم صورة العينة تحت المجهر. وقد استخدم هذا البروتوكول لإنشاء خط عقيم الذكور من قبل التحول الجيني بوساطة Agrobacterium في الأرز.استعملت ال "كاليّ" جنينيّة كان مباشرة للتحويل أو تربية فرعيّة للانتشار أن ينال أكثر كالّي ل عدوى بعيد. بعد الزراعة المشتركة لمدة 48 ساعة، تم نقل كالي إلى جولة ثانية من وسيط الاختيار. بعد 10 إلى 14 يوما، أظهرت كالي تحويلها microcalli شكلت حديثا في حين أن كالي غير مُنَتَهَم تحول إلى اللون البني ومات.في وقت لاحق، تم نقل كالي الملونة صحية ودسمة في وسط التجديد. وأظهرت كالي تحول تدريجيا البقع الخضراء. وقد تم استزراع هذه البقع الخضراء في وسط التجديد للسماح بنمو إطلاق النار ثم تحولت إلى نصف متوسطة MS للحث على الجذور.في وقت لاحق، تم حصاد براعم النمو صحية وقوية مع جذور متطورة. وفي المجموع، تم الحصول على 21 شتلة مجددة. بيّن تضخيم PCR لمنطقة هيغروميسين أن تردد التحول كان حوالي 85.71٪ تم تحديد الجينومية للتحويلات لتحديد الطفرات في المواقع المستهدفة من sgRNA.من بين 18 النباتات المعدلة وراثيا، ثمانية خطوط heterozygous وثلاثة خطوط homozygous كانت CRISPR CAS9 إيجابية. تم التحقق من صحة المسوخ المهزوخ بالضربة القاضية من قبل ملاحظة الجهاز التناسلي الذكور الأساسية. كانت اثيرات osabcg15 أصغر وأكثر شحوبا من تلك من النوع البرية وتفتقر إلى حبوب اللقاح الناضجة.تم إجراء مجهري المقطع العرضية للتحقيق في العيوب المورفولوجية في osabcg15. في المرحلة 10 ، أصبحت الجراثيم الدقيقة من النوع البري مستديرة الشكل ومشوشة مع exine الملون الأزرق الداكن. وعلى النقيض من ذلك، انهارت الجراثيم المجهرية osabcg15 وتدهورت.عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم التأكد من أن المواد التي تم جمعها في مرحلة الداء الوسيم والتحكم في وقت جفاف الهواء من كالي.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

وسلم المشي رونغ العمل : نظام تسجيل النقاط وتطبيقها العملي.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

زرع عدسة في اسماك الزرد وتطبيقاتها في تحليل المسوخ العين

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

المعدلة وراثيا القوارض الفحص لقياس ذكر جرثومة خلية متحولة التردد

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

البكتريا الزراعية-بوساطة تحويل الجنين غير الناضج من خطوط الذرة المستعبدة المستنعين باستخدام الجينات المورجينية

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

الكشف في الوقت الحقيقي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الاستجابة المناعية في الأرز باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...