Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Xiaofei Chen for at give de unge ris blomsterstande og bistand til at gøre ris væv kultur medium. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31900611).

1. sgRNA-CAS9 planteudtryk vektor konstruktion og Agrobacterium-medierettransformation
<ol><li>Målret mod et sterilt hanegenOsABCG15 i ris i henhold til den offentliggjorte litteratur28.</li>
	<li>Design sgRNA for det målrettede sted placeret mellem 106-125 bp i den anden exon af OsABCG15 (Figur 1).</li>
	<li>Brug T4 polynukleotid kinase til at syntetisere sgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' og 5'sgR-OsABCG15-R: AA...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

Kunstige gengene mandlige sterile mutanter genereres traditionelt ved tilfældig fysisk, kemisk eller biologisk mutagenese. Selv om disse er kraftfulde teknikker, deres tilfældige karakter undlader at udnytte den enorme mængde af moderne genomisk viden, der har potentiale til at levere skræddersyede forbedringer i molekylæravl 32. CRISPR-Cas9-systemet har været meget udbredt i planter på grund af dets enkle og overkommelige midler til at manipulere og redigere DNA29<s...

Ris er den vigtigste fødevareafgrøde, især i udviklingslandene, og udgør en basisfødevare til over halvdelen af verdens befolkning. Samlet set vokser efterspørgslen efter riskorn og forventes at stige med 50 % i 2030 og 100 % i 20501,2. Fremtidige forbedringer i ris udbytte bliver nødt til at udnytte forskellige molekylære og genetiske ressourcer, der gør ris en glimrende model for monocotyledonous plante forskning. Disse omfatter et effektivt transformationssystem, avanceret molekylærkort og offentligt tilgængelig database over udtrykte sekvenskoder, som er blevet genereret over mangeår 3,,4. En strategi for at forbedre høstudbyttet er hybridfrøproduktion 5, et centralt element, som er evnen til at manipulere mandlige frugtbarhed. En forståelse af den molekylære kontrol af mænds frugtbarhed i kornafgrøder kan bidrage til at omsætte vigtig viden til praktiske teknikker til at forbedre produktionen af hybridfrø og øgeafgrødeproduktiviteten 6,7.
Genetisk transformation er et vigtigt redskab for grundforskning og kommercielt landbrug, da det muliggør indførelse af fremmede gener eller manipulation af endogene gener i afgrøder, og resulterer i generering af genetisk modificerede linjer. En passende transformationsprotokol kan bidrage til at fremskynde genetiske og molekylære biologiundersøgelser med henblik på grundlæggende forståelse afgenregulering 8. I bakterier, genetisk transformation finder sted naturligt; men i planter, det udføres kunstigt ved hjælp af molekylærbiologiteknikker 9,10. Agrobacterium tumefaciens er en jordbåren, Gram-negativ bakterie, der forårsager kronen galdesygdom i planter ved at overføre T-DNA, en region af sin Ti plasmid, i plantecellen via en type IV sekretion system11,12. I planter, A. tumefaciens-medierettransformation betragtes som en udbredt metode til gen modifikation, fordi det fører til stabil og lav kopi nummer integration af T-DNA i værten genom13. Transgene ris blev først genereret gennem Agrobacterium-medieretgen transformation i midten af 1990'erne i japonica sorten14. Ved hjælp af denne protokol blev flere transgene linjer opnået inden for en periode på 4 måneder med en transformationseffektivitet på 10-30 %. Undersøgelsen viste, at der er to kritiske skridt for en vellykket transformation: den ene er induktion af embryogene callus fra modne frø og en anden er tilsætning af acetosyringone, en phenolforbindelse, til bakteriekultur under co-dyrkning, som giver mulighed for højere transformation effektivitet iplanterne 14,,15. Denne protokol er blevet flittigt anvendt med mindre ændringer i japonica16,17,18,19 samt andre sorter såsom indica20,21,22,23 og tropiske japonica24,25. Faktisk over 80% af de artikler, der beskriver ris transformation bruge Agrobacterium-medieretgen transformation som et værktøj13. Til dato er der udviklet flere genetiske transformationsprotokoller ved hjælp af risfrø som udgangsmateriale til kalustiluktion16,17,18,19. Men meget lidt er kendt om unge blomsterstand som explants for callus produktion. Samlet set er det vigtigt at etablere en hurtig, reproducerbar og effektiv gentransformings- og regenereringsprotokol for funktionel genomforskning og undersøgelser af afgrødeforbedring.
I de senere år har udviklingen af CRISPR-Cas9-teknologien resulteret i en præcis genomredigeringsmekanisme til at forstå genfunktionen og levere agronomisk vigtige forbedringer tilplanteavl 26,27. CRISPR giver også et betydeligt løfte om manipulation af mandlig reproduktiv udvikling og hybridproduktion. I denne undersøgelse anvendte vi et gen knockout system ved hjælp af CRISPR-Cas9 teknologi og koblet det til en effektiv ris gen transformation protokol ved hjælp af unge blomsterstande som explants, og dermed skabe stabile mandlige sterile linjer til studiet af reproduktiv udvikling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

Mandlig sterilitet er et vigtigt agronomisk træk for hybrid frøproduktion, der normalt er karakteriseret ved funktionelle defekter i mandlige kønsorganer / gameter. De seneste fremskridt inden for CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi giver mulighed for høj redigeringseffekt og tidsbesparende knockout-mutationer af endogene kandidatgener på bestemte steder. Derudover er Agrobacterium-medieretgenetisk transformation af ris også en vigtig metode til genændring, som er blevet bredt vedtaget af mange offentlige og private laboratorier. I denne undersøgelse anvendte vi CRISPR-Cas9 genomredigeringsværktøjer og genererede med succes tre sterile hanegenterlinjer ved målrettet genomredigering af OsABCG15 i en japonicasortiment. Vi brugte en modificeret Agrobacterium-medieretris transformation metode, der kunne give fremragende midler til genetisk emasculation for hybrid frøproduktion i ris. Transgene planter kan fås inden for 2-3 måneder og homozygot transformanter blev screenet ved genotypebestemmelse ved hjælp af PCR forstærkning og Sanger sekventering. Grundlæggende fæotypisk karakterisering af den mandlige sterile homozygot linje blev udført ved mikroskopisk observation af ris mandlige kønsorganer, pollen levedygtighed analyse af jod kalium iodid (I2-KI) farvning semi-tynde tværsnit af udvikle anthers.

Demonstreret her er brugen af genredigering teknologi til at skabe en mandlig steril linje for fremtidig forskning af Agrobacterium-medieretgenetisk transformation i ris. For at skabe den mandlige sterile linje osabcg15, CRISPR-CAS9-medieret mutagenese blev brugt til binær vektor konstruktion. SgRNA var drevet af OsU3 promotor, mens udtrykket kassette af hSpCas9 var drevet af den dobbelte 35S promotor, og den midterste vektor blev samlet i en enkelt binær vektor pCAMBIA1300 designet til A...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Dette arbejde beskriver brugen af CRISPR-Cas9 genom redigering teknologi til knockout endogene gen OsABCG15 efterfulgt af en modificeret Agrobacterium-medierettransformation protokol til at producere en stabil mand-steril linje i ris.

Agrobacterium-medieretgenetisk transformation, transgene produktion, og dens anvendelse til undersøgelse af mandlige reproduktive udvikling i ris

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Unge blomsterstande som explant for callus produktion er vigtige for at etablere en hurtig og effektiv gentransformation og en regenerering metode til at afsløre genfunktion samt for afgrøde forbedring. Unge blomsterstande som explant for callus produktion er vigtige for at etablere en hurtig og effektiv gentransformation og regenereringsmetoden til at afsløre genfunktion. Video demonstration af denne teknik vil hjælpe seeren forstå processen med at opretholde de materialer til at producere, at ønskede transgene tilpasse uden at spilde tid og kræfter.Begynd med at indsamle unge ris blomsterstande fra uafskallet mark eller et drivhus på meiose fase, og sørg for, at de er dækket med bladet kappe. Tør hver blomsterstand med en 70% alkohol podning og lad det tørre før skæring. Bring blomsterstanden til en steril laboratoriebænk og skær den i små stykker med steriliseret saks, og overfør derefter stiklingerne til en petriplade, der indeholder NBD2-mediet.Inkuber pladen i mørke ved 26 grader Celsius i 10 til 14 dage for at fremkalde callus. For at udføre transformation, overføre en enkelt koloni fra den hvide EB plade med selektive antibiotika til fem milliliter flydende YEB medium, der indeholder de samme antibiotika i en 50 milliliter konisk sterile reagensglas. Ryst røret på en orbital shaker ved 250 gange g og 25 til 28 grader Celsius, indtil bakterier vokser til en OD 600 på 0,5.Der tilsættes en milliliter bakteriel suspension til 100 milliliter YEB-medium med samme selektive antibiotika i en konisk kolbe på 250 milliliter og kolben rystes ved 250 gange g og 28 grader Celsius i fire timer. Centrifuge kulturen på 4, 000 g i 10 minutter ved stuetemperatur for at indsamle bakterier. Kassér supernatanten og opspnør pellet med AAM AS medium, derefter fortyndes suspensionen til en OD 600 på 0,4.Efter inkubationen indsamles omkring 150 sunde, lysegule embryogene calli i en 150 milliliter steril kolbe. Der tilsættes 50 til 75 milliliter af bakteriecellesuspensionen i kolben, og der tilsættes derefter 10 til 25 milliliter frisk AAM AS-medium for at nedsænke calli i 10 til 20 minutter, og der omrystes lejlighedsvis. Hæld bakteriesuspensionen ud af kolben omhyggeligt, og tør calli med sterilt filterpapir, og læg dem derefter på en petriskål med NBD AS-medium og dæk dem med filterpapir.Inkuber calli ved 25 til 28 grader Celsius i mørke i tre dage, kontrollere dem for bakteriel overvækst. Efter tre dages co-dyrkning, overføre calli til en steril Petri fad ved hjælp af filterpapir, derefter lufttørre dem i to timer på en ren bænk. Sørg for, at calli'en ikke overholdes filterpapiret, og overfør dem til det primære valgmedie NBD2.Efter to uger, overføre calli jævnt til en ny plade, der indeholder frisk udvælgelse medium, derefter flytte calli til frisk MS medium for differentiering og skyde knopper til MS medium med 10 milligram per liter Hygromycin at formere flere skud. Overfør de nye skud i halv MS medium for rod induktion og kultur dem under lys ved 25 til 28 grader Celsius. De transformerede planter skal producere rødder inden for to uger.For at udføre reproduktiv fænotype observation, fjerne palea og lemma fra florid og billede hele anthers under et stereomikroskop. At observere pollen levedygtighed, vælge modne ris småakse før blomsten antese og fjerne palea og lemma at frigive anthers. Tag seks anthers og læg dem på et glas dias.Tilsæt en dråbe destilleret vand, knuse anther med pincet til at frigive pollen korn, derefter tilføje to til tre dråber jod opløsning og dække med en coverslip. Overhold diaset under et mikroskop med lav forstørrelse. Pollen korn farvet sort viser mere energisk levedygtighed, mens korn uden farve eller dem farvet gul brun er hæmmet eller degenereret.For at udføre tværgående sektion mikroskopi, bruge 0,5% toluidin blå opløsning til at plette dias i 30 minutter, derefter skylles dem med vand og tørre dem i røghætten. Når tør, forsegle dias med neutral træ lim, forsigtigt placere en dækslæb på diaset og tørre dem i røghætten, derefter billede prøven under et mikroskop. Denne protokol blev brugt til at skabe en mandlig steril linje af Agrobacterium-medieret genetisk transformation i ris.Den embryogene calli blev direkte brugt til transformation eller subkultureret til spredning for at opnå mere calli for yderligere infektion. Efter co-dyrke i 48 timer, calli blev flyttet til en anden runde af udvælgelse medium. Efter 10 til 14 dage, forvandlet calli viste nydannede microcalli mens den utransformede calli blev brun og døde.Senere, sund og cremet farvet calli blev overført til regenerering medium. Den forvandlede calli viste gradvist grønne pletter. Disse grønne pletter blev dyrket i regenerering medium for at give mulighed for at skyde vækst og derefter flyttet til halvdelen MS medium til at fremkalde rødder.Senere, sunde og energisk voksende skud med veludviklede rødder blev høstet. I alt blev der opnået 21 regenererede planter. PCR forstærkning for Hygromycin regionen viste, at transformationsfrekvensen var ca 85.71%Transformanterne blev genotypet at identificere mutationer på sgRNA mål steder.Blandt de 18 transgene planter var otte heterozygotelinjer og tre homozygotlinjer CRISPR CAS9 positive. De homozygot knockout mutanter blev valideret ved grundlæggende mandlige reproduktive organ observation. Anthers af osabcg15 var mindre og blegere end af den vilde type og manglede modne pollen korn.Der blev udført tværgående tværsnitsmikroskopi for at undersøge anthermorfologiske defekter i osabcg15. På trin 10 blev mikrosporer af vildtypen rundformet og vakuoleret med mørkeblå farvede eksin. I modsætning hertil kollapsede osabcg15 mikrosporerne og forringede.Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at sikre, at det indsamlede materiale er i meiose fase og til at styre lufttørre tid calli.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering og udnyttelse af<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medieret Forbigående Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgene gnaver Assay til Quantifying Mand Kimcelle mutanthyppighed

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

En multi-hul kryohætteglas Eliminerer Frysning Artefakter når muskelvæv er direkte Nedsænket i flydende nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Medieret Umodne Embryo Transformation af genstridige majs indavlede linjer Ved hjælp af morfoenske gener

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Realtidspåvisning af produktion af reaktive iltarter i immunrespons i ris med et kemiluminescensassay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...