Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Xiaofei Chen d’avoir fourni les jeunes inflorescences de riz et d’avoir aidé à faire de la culture des tissus de riz un milieu. Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31900611).

1. construction vectorielle d’expression végétale sgRNA-CAS9 et transformation sous médiation Agrobacterium
<ol><li>Cibler un gène stérile mâle OsABCG15 dans le riz selon la littérature publiée28.</li>
	<li>Conception sgRNA pour le site ciblé situé entre 106-125 pb dans le deuxième exon d’OsABCG15 (Figure 1).</li>
	<li>Utilisez la kinase de polynucléotide T4 pour synthétiser les oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F : 5'TGGCAAGCATC...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

Les mutants stériles mâles géniques artificiels sont traditionnellement générés par une mutagenèse physique, chimique ou biologique aléatoire. Bien qu’il s’agit de techniques puissantes, leur nature aléatoire ne parvient pas à tirer parti de la grande quantité de connaissances génomiques modernes qui a le potentiel d’apporter des améliorations sur mesure dans la reproduction moléculaire32. Le système CRISPR-Cas9 a été largement utilisé dans les plantes en raison de ses moye...

Le riz est la culture alimentaire la plus importante, en particulier dans les pays en développement, et représente un aliment de base pour plus de la moitié de la population mondiale. Dans l’ensemble, la demande de céréales de riz augmente et devrait augmenter de 50 % d’ici 2030 et de 100 % d’ici 20501,2. Les améliorations futures du rendement du riz devront tirer parti de diverses ressources moléculaires et génétiques qui font du riz un excellent modèle pour la recherche sur les plantes monocotyledonous. Il s’agit notamment d’un système de transformation efficace, d’une carte moléculaire avancée et d’une base de données accessible au public des balises de séquence exprimées, qui ont été générées sur de nombreuses années3,4. Une stratégie pour améliorer le rendement des cultures est la production de semences hybrides5, dont un élément central est la capacité de manipuler la fertilité masculine. Comprendre le contrôle moléculaire de la fertilité masculine dans les cultures céréalières peut aider à traduire les connaissances clés en techniques pratiques pour améliorer la production de semences hybrides et améliorer la productivité des cultures6,7.
La transformation génétique est un outil clé pour la recherche fondamentale et l’agriculture commerciale, car elle permet l’introduction de gènes étrangers ou la manipulation de gènes endogènes dans les plantes cultivées, et entraîne la génération de lignées génétiquement modifiées. Un protocole de transformation approprié peut aider à accélérer les études de biologie génétique et moléculaire pour la compréhension fondamentale de la régulation des gènes8. Chez les bactéries, la transformation génétique a lieu naturellement; cependant, dans les plantes, il est effectué artificiellement en utilisant des techniques de biologie moléculaire9,10. Agrobacterium tumefaciens est une bactérie gramnégative transmise par le sol qui cause la maladie de la gale de la couronne chez les plantes en transférant t-ADN, une région de son Plasmide Ti, dans la cellule végétale via un système de sécrétion de type IV11,12. Chez les plantes, la transformation sous médiation A. tumefaciensest considérée comme une méthode répandue de modification génétique parce qu’elle conduit à l’intégration stable et faible du nombre de copies de l’ADN T dans le génome hôte13. Le riz transgénique a été généré pour la première fois par la transformation des gènes sous médiation Agrobacteriumau milieu des années 1990 dans le cultivarjaponica 14. À l’aide de ce protocole, plusieurs lignées transgéniques ont été obtenues en l’espace de 4 mois avec une efficacité de transformation de 10 à 30 %. L’étude a indiqué qu’il y a deux étapes critiques pour la transformation réussie : l’une est l’induction du callus embryogène des graines mûres et l’autre est l’addition de l’acétosyringone, un composé phénolique, à la culture bactérienne pendant la co-culture, qui permet une plus grande efficacité de transformation dans les plantes14,15. Ce protocole a été largement utilisé avec des modifications mineures dans japonica16,17,18,19 ainsi que d’autres cultivars tels que indica20,21,22,23 et tropical japonica24,25. En effet, plus de 80 % des articles décrivant la transformation du riz utilisent la transformation génétique d’Agrobacteriumcomme outil13. À ce jour, plusieurs protocoles de transformation génétique ont été développés en utilisant les semences de riz comme matériau de départ pour l’induction de callus16,17,18,19. Cependant, on sait très peu de choses sur l’inflorescence des jeunes comme explants pour la production de callus. Dans l’ensemble, il est important d’établir un protocole de transformation et de régénération des gènes rapide, reproductible et efficace pour la génomique fonctionnelle et les études sur l’amélioration des cultures.
Ces dernières années, l’avancement de la technologie CRISPR-Cas9 a abouti à un mécanisme précis d’édition du génome pour comprendre la fonction des gènes et apporter des améliorations agronomiquement importantes pour la sélection végétale26,27. CRISPR offre également des promesses considérables pour la manipulation du développement reproducteur masculin et de la production hybride. Dans cette étude, nous avons utilisé un système de knock-out de gène utilisant la technologie CRISPR-Cas9 et l’avons couplé à un protocole efficace de transformation de gène de riz utilisant de jeunes inflorescences comme explants, créant ainsi des lignes stériles mâles stables pour l’étude du développement reproducteur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
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agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

La stérilité masculine est un trait agronomique important pour la production de semences hybrides qui se caractérise habituellement par des défauts fonctionnels dans les organes reproducteurs mâles/gamètes. Les progrès récents de la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9 permettent une efficacité d’édition élevée et des mutations par KO de gènes candidats endogènes à des sites spécifiques. En outre, la transformation génétique du riz par agrobactérieest également une méthode clé pour la modification des gènes, qui a été largement adoptée par de nombreux laboratoires publics et privés. Dans cette étude, nous avons appliqué des outils d’édition du génome CRISPR-Cas9 et avons réussi à générer trois lignées mutantes stériles mâles par modification du génome ciblée d’OsABCG15 dans un cultivar japonica. Nous avons utilisé une méthode modifiée de transformation du riz sous médiation agrobactériequi pourrait fournir d’excellents moyens d’émasculation génétique pour la production de semences hybrides dans le riz. Les plantes transgéniques peuvent être obtenues dans un délai de 2 à 3 mois et les transformateurs homozygotes ont été examinés par génotypage à l’aide de l’amplification pcr et du séquençage sanger. La caractérisation phénotypique de base de la ligne mâle d’homozygote stérile a été exécutée par l’observation microscopique des organes reproducteurs mâles de riz, l’analyse de viabilité de pollen par l’iodure de potassium d’iode (I2-KI) tachetant semi-mince-sectionment de développement des anthers.

Il est démontré ici l’utilisation de la technologie d’édition de gènes pour créer une ligne stérile masculine pour la recherche future par Agrobacterium-médié transformation génétique dans le riz. Pour créer la ligne stérile mâle d’osabcg15, la mutagenèse à médiation CRISPR-CAS9 a été utilisée pour la construction de vecteurs binaires. Le sgRNA a été piloté par le promoteur OsU3, tandis que la cassette d’expression de hSpCas9 a été entraînée par le double promoteur 35S,...

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Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Ce travail décrit l’utilisation de la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9 pour éliminer le gène endogène OsABCG15 suivi d’un protocole de transformation modifié sous médiation agrobactériepour produire une lignée stable mâle-stérile dans le riz.

Agrobacterium-Transformation génétique médiée, production transgénique et application pour l’étude du développement de la reproduction masculine dans le riz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Les jeunes inflorescences en tant qu’explant pour la production de callus sont importantes pour établir une transformation génétique rapide et efficace et une méthode de régénération pour révéler la fonction génétique ainsi que pour l’amélioration des cultures. Les jeunes inflorescences en tant qu’explant pour la production de callus sont importantes pour établir une transformation génétique rapide et efficace et la méthode de régénération pour révéler la fonction génétique. La démonstration vidéo de cette technique aidera le spectateur à comprendre le processus d’entretien des matériaux pour produire l’alignement transgénique désiré sans perdre de temps et d’efforts.Commencez par recueillir de jeunes inflorescences de riz dans la rizière ou une serre à l’étape de la méiose, en vous assurant qu’ils sont recouverts de la gaine des feuilles. Essuyer chaque inflorescence avec un écouvillon à 70% d’alcool et laisser sécher avant de couper. Apportez l’inflorescence sur un banc de laboratoire stérile et coupez-la en petits morceaux avec des ciseaux stérilisés, puis transférez les boutures sur une plaque Petri contenant du milieu NBD2.Incuber la plaque dans l’obscurité à 26 degrés Celsius pendant 10 à 14 jours pour induire le callus. Pour effectuer la transformation, transférez une seule colonie de la plaque EB blanche avec des antibiotiques sélectifs à cinq millilitres de liquide YEB moyen contenant les mêmes antibiotiques dans un tube à essai stérile conique de 50 millilitres. Secouez le tube sur un shaker orbital à 250 fois g et 25 à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que les bactéries se développent à un OD 600 de 0,5.Ajouter un millilitre de suspension bactérienne à 100 millilitres de milieu YEB avec les mêmes antibiotiques sélectifs dans un flacon conique de 250 millilitres et secouer le flacon sur un shaker orbital à 250 fois g et 28 degrés Celsius pendant quatre heures. Centrifugez la culture à 4000 g pendant 10 minutes à température ambiante pour recueillir les bactéries. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille avec le milieu AAM AS, puis diluez la suspension à un OD 600 de 0,4.Après l’incubation, recueillir environ 150 calli embryogénique jaune clair sain dans un flacon stérile de 150 millilitres. Ajouter 50 à 75 millilitres de suspension cellulaire bactérienne dans le flacon, puis ajouter 10 à 25 millilitres de milieu AAM AS frais pour immerger le calli pendant 10 à 20 minutes, en secouant de temps en temps. Versez soigneusement la suspension bactérienne hors du flacon et séchez le calli avec du papier filtre stérile, puis placez-les sur une boîte de Pétri avec le milieu NBD AS et recouvrez-les de papier filtre.Incubez le calli à 25 à 28 degrés Celsius dans l’obscurité pendant trois jours, en vérifiant la surcroissance bactérienne. Après trois jours de co-culture, transférer le calli dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de papier filtre, puis les sécher à l’air pendant deux heures sur un banc propre. Assurez-vous que les calli ne sont pas respectés au papier filtre et transférez-les vers le support de sélection primaire NBD2.Après deux semaines, transférez le calli uniformément dans une nouvelle plaque contenant un milieu de sélection frais, puis déplacez le calli vers un milieu de SP frais pour la différenciation et les bourgeons de la pousse au milieu de la SP avec 10 milligrammes par litre d’hygromycine pour proliférer plus de pousses. Transférer les nouvelles pousses dans la moitié du milieu de la SP pour l’induction des racines et les culture sous la lumière à 25 à 28 degrés Celsius. Les plantes transformées devraient produire des racines dans les deux semaines.Pour effectuer l’observation de phénotype reproducteur, retirez la palea et la lemme du fleuri et imagez les anthères entières sous un microscope stéréo. Pour observer la viabilité du pollen, cueillez des pointes de riz matures avant l’anthèse florale et retirez la palea et la lemme pour libérer les anthères. Prenez six anthères et placez-les sur une toboggan en verre.Ajouter une goutte d’eau distillée, écraser l’anthère avec des pinces à épiler pour libérer les grains de pollen, puis ajouter deux à trois gouttes de solution d’iode et couvrir d’un coverslip. Observez la glissade au microscope à faible grossissement. Les grains de pollen colorants en noir montrent une viabilité plus vigoureuse tandis que les grains sans couleur ou ceux de brun jaune colorant sont rabougris ou dégénérés.Pour effectuer la microscopie transversale de sectionnement, utilisez la solution bleue de toluidine de 0,5% pour tacher les glissières pendant 30 minutes, puis rincez-les avec de l’eau et séchez-les dans le capot de fumée. Une fois secs, sceller les glissières avec de la colle d’arbre neutre, placer délicatement un couvercle sur la glissière et les sécher dans le capot de fumée, puis l’image de l’échantillon sous un microscope. Ce protocole a été utilisé pour créer une lignée stérile masculine par agrobactérie ment médiatisée transformation génétique dans le riz.Les calli embryogéniques ont été directement utilisés pour la transformation ou sous-cultivés pour la prolifération afin d’obtenir plus de calli pour d’autres infections. Après avoir co-cultivé pendant 48 heures, les calli ont été déplacés vers un deuxième tour de sélection moyen. Après 10 à 14 jours, calli transformé a montré le microcalli nouvellement formé tandis que le calli non transformé est devenu brun et est mort.Plus tard, des calli colorés sains et crémeux ont été transférés dans le milieu de régénération. Les calli transformés ont progressivement montré des taches vertes. Ces taches vertes ont été cultivés dans le milieu de régénération pour permettre la croissance des pousses, puis déplacées en deux médiums de SP pour induire des racines.Plus tard, des pousses saines et vigoureuses aux racines bien développées ont été récoltées. Au total, 21 semis régénérés ont été obtenus. L’amplification de PCR pour la région d’Hygromycin a prouvé que la fréquence de transformation était approximativement 85.71%Les transformateurs ont été génotypés pour identifier les mutations aux emplacements cibles de sgRNA.Parmi les 18 plantes transgéniques, huit lignées hétérozygotes et trois lignées homozygotes étaient positives CRISPR CAS9. Les mutants homozygotes knockout ont été validés par l’observation masculine de base des organes reproducteurs. Les anthères d’osabcg15 étaient plus petites et plus pâles que celles du type sauvage et manquaient de grains de pollen matures.La microscopie transversale de section a été exécutée pour étudier les défauts morphologiques d’anthère dans osabcg15. Au stade 10, les microspores de type sauvage sont devenues rondes et vacuolées avec de l’exine teintée de bleu foncé. En revanche, les microspores osabcg15 se sont effondrées et dégradées.Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de s’assurer que le matériel recueilli est au stade de la méiose et de contrôler le temps de séchage de l’air du calli.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Test sensibilité visuelle à la vitesse et la direction du mouvement chez les lézards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Recherche

Biologie

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Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

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Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

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Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

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Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans l&#39;azote liquide

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Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Transformation d’embryon immature médié des lignées consanguines de maïs récalcitrants utilisant des gènes morphogènes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Détection en temps réel de la production d’espèces réactives de l’oxygène dans la réponse immunitaire dans le riz avec un test de chimiluminescence

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...