Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Die Autoren würdigen Xiaofei Chen für die Bereitstellung der jungen Reisblüten und Hilfe bei der Herstellung der Reisgewebekultur Medium. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31900611) unterstützt.

1. sgRNA-CAS9 Pflanzenexpressionsvektorkonstruktion und Agrobacterium-vermittelte Transformation
<ol><li>Ziel eines männlichen sterilen Genos OsABCG15 in Reis nach der veröffentlichten Literatur28.</li>
	<li>Entwerfen Sie sgRNA für den Zielstandort zwischen 106–125 bp im zweiten Exon von OsABCG15 (Abbildung 1).</li>
	<li>Verwenden Sie T4-Polynukleotidkinase, um die sgRNA-Oligos zu synthetisieren (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGG...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

Künstliche genegene männliche sterile Mutanten werden traditionell durch zufällige physikalische, chemische oder biologische Mutagenese erzeugt. Obwohl dies mächtige Techniken sind, kann ihre zufällige Natur nicht aus der riesigen Menge an modernem genomischem Wissen Kapital schlagen, das das Potenzial hat, maßgeschneiderte Verbesserungen in der molekularen Züchtung zu liefern32. Das CRISPR-Cas9-System ist aufgrund seiner einfachen und erschwinglichen Möglichkeiten zur Manipulation und Bea...

Reis ist die wichtigste Nahrungsmittelpflanze, insbesondere in Entwicklungsländern, und stellt für mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung ein Grundnahrungsmittel dar. Insgesamt wächst die Nachfrage nach Reisgetreide und wird bis 2030 voraussichtlich um 50 % und bis 2050 um 100 % ansteigen1,2. Zukünftige Verbesserungen des Reisertrags müssen aus verschiedenen molekularen und genetischen Ressourcen kapitalisieren, die Reis zu einem ausgezeichneten Modell für monokotyledonöse Pflanzenforschung machen. Dazu gehören ein effizientes Transformationssystem, fortschrittliche molekulare Karte und öffentlich zugängliche Datenbank von ausgedrückten Sequenz-Tags, die über viele Jahre generiert wurden3,4. Eine Strategie zur Verbesserung des Ernteertrags ist die Hybridsaatgutproduktion5, ein zentrales Element davon ist die Fähigkeit, die männliche Fruchtbarkeit zu manipulieren. Das Verständnis der molekularen Kontrolle der männlichen Fruchtbarkeit in Getreidepflanzen kann dazu beitragen, Schlüsselwissen in praktische Techniken umzusetzen, um die Hybridsaatgutproduktion zu verbessern und die Ernteproduktivität zu verbessern6,7.
Die genetische Transformation ist ein Schlüsselinstrument für die Grundlagenforschung und die kommerzielle Landwirtschaft, da sie die Einführung fremder Gene oder die Manipulation endogener Gene in Kulturpflanzen ermöglicht und zur Erzeugung genetisch veränderter Linien führt. Ein geeignetes Transformationsprotokoll kann dazu beitragen, genetische und molekularbiologische Studien für ein grundlegendes Verständnis der Genregulation zu beschleunigen8. Bei Bakterien findet die genetische Transformation auf natürliche Weise statt; jedoch wird es in Pflanzen künstlich mit molekularbiologischen Techniken9,10durchgeführt. Agrobacterium tumefaciens ist ein bodengestütztes, gramnegatives Bakterium, das Kronengallenerkrankungen in Pflanzen verursacht, indem es T-DNA, eine Region seines Ti-Plasmids, über ein Sekretionssystem vom Typ IV11,12in die Pflanzenzelle überträgt. In Pflanzen wird die A. tumefaciens-vermittelte Transformation als weit verbreitete Methode zur Genmodifikation betrachtet, da sie zu einer stabilen und niedrigen Kopierzahl der Integration von T-DNA in das Wirtsgenom13führt. Transgener Reis wurde erstmals Mitte der 1990er Jahre durch Agrobacterium-vermittelte Gentransformation in der Japonica-Sorte14erzeugt. Mit diesem Protokoll wurden innerhalb von 4 Monaten mehrere transgene Leitungen mit einer Transformationseffizienz von 10%–30% erhalten. Die Studie zeigte, dass es zwei entscheidende Schritte für die erfolgreiche Transformation gibt: einer ist die Induktion von embryogenen Callus aus reifen Samen und ein anderer ist die Zugabe von Acetosyringon, einer Phenolverbindung, zur Bakterienkultur während der Kokultivierung, die eine höhere Transformationseffizienz in Pflanzenermöglicht 14,15. Dieses Protokoll wurde ausgiebig mit kleineren Änderungen in japonica16,17,18,19 sowie anderen Sorten wie Indica20,21,22,23 und tropischen japonica24,25verwendet. Tatsächlich verwenden über 80% der Artikel, die die Reistransformation beschreiben, Agrobacterium-vermittelte Gentransformation als Werkzeug13. Bis heute wurden mehrere genetische Transformationsprotokolle entwickelt, die Reissamen als Ausgangsmaterial für die Callusinduktion16,17,18,19verwenden. Über den jungen Blütenstand als Explants für die Callusproduktion ist jedoch nur sehr wenig bekannt. Insgesamt ist es wichtig, ein schnelles, reproduzierbares und effizientes Gentransformations- und Regenerationsprotokoll für die funktionelle Genomik und Studien zur Verbesserung von Pflanzen zu erstellen.
In den letzten Jahren hat die Weiterentwicklung der CRISPR-Cas9-Technologie zu einem präzisen Genom-Editing-Mechanismus geführt, um die Genfunktion zu verstehen und agronomisch wichtige Verbesserungen für die Pflanzenzüchtung zu liefern26,27. CRISPR bietet auch erhebliche Versprechen für die Manipulation der männlichen Reproduktionsentwicklung und Hybridproduktion. In dieser Studie nutzten wir ein Gen-Knockout-System mit CRISPR-Cas9-Technologie und koppelten es an ein effizientes Reisgentransformationsprotokoll, das junge Blütenstände als Explanten verwendete, wodurch stabile männliche sterile Linien für die Untersuchung der Reproduktionsentwicklung geschaffen wurden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

Männliche Sterilität ist eine wichtige agronomische Eigenschaft für die Hybridsamenproduktion, die in der Regel durch funktionelle Defekte in männlichen Fortpflanzungsorganen/Gameten gekennzeichnet ist. Jüngste Fortschritte in der CRISPR-Cas9-Genom-Editing-Technologie ermöglichen eine hohe Editing-Wirksamkeit und zeitsparende Knockout-Mutationen endogener Kandidatengene an bestimmten Standorten. Darüber hinaus ist Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation von Reis auch eine Schlüsselmethode zur Genmodifikation, die von vielen öffentlichen und privaten Laboratorien weit verbreitet ist. In dieser Studie haben wir CRISPR-Cas9 Genombearbeitungswerkzeuge eingesetzt und erfolgreich drei männliche sterile Mutantlinien durch gezielte Genombearbeitung von OsABCG15 in einer Japonica-Sorte erzeugt. Wir verwendeten eine modifizierte Agrobacterium-vermittelteReistransformationsmethode, die hervorragende Mittel zur genetischen Easculation für die Hybridsamenproduktion in Reis bieten konnte. Transgene Pflanzen können innerhalb von 2–3 Monaten erhalten werden und homozygote Transformanten wurden durch Genotypisierung mittels PCR-Amplifikation und Sanger-Sequenzierung gescreent. Die grundlegende phänotypische Charakterisierung der männlichen sterilen homozygoten Linie wurde durch mikroskopische Beobachtung der männlichen Reisvermehrungsorgane, Pollenlebensfähigkeitsanalyse durch Jodkaliumjodid (I2-KI) durchgeführt, indem halbdünne Querschnitte von sich entwickelnden Anthern färben.

Gezeigt wird hier der Einsatz von Gen-Editing-Technologie, um eine männliche sterile Linie für zukünftige Forschung von Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation in Reis zu schaffen. Um die männliche sterile Linie von osabcg15zu erstellen, wurde CRISPR-CAS9-vermittelte Mutagenese für die binäre Vektorkonstruktion verwendet. Die sgRNA wurde vom OsU3-Promotor angetrieben, während die Expressionskassette von hSpCas9 vom doppelten 35S-Promotor angetrieben wurde und der mittlere Vektor in ei...

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Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Diese Arbeit beschreibt den Einsatz der CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Technologie, um das endogene Gen OsABCG15 zu knockouten, gefolgt von einem modifizierten Agrobacterium-vermitteltenTransformationsprotokoll, um eine stabile männlich-sterile Linie in Reis zu produzieren.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Junge Blütenstände als Explantation für die Callusproduktion sind wichtig, um eine schnelle und effiziente Gentransformation und eine Regenerationsmethode zur Aufdeckung der Genfunktion sowie zur Verbesserung der Ernte zu etablieren. Junge Blütenstände als Explantation für die Callusproduktion sind wichtig, um eine schnelle und effiziente Gentransformation und die Regenerationsmethode zur Enthüllung der Genfunktion zu etablieren. Video-Demonstration dieser Technik wird dem Betrachter helfen, den Prozess der Wartung der Materialien zu verstehen, um die gewünschte transgene Ausrichtung zu produzieren, ohne Zeit und Mühe zu verschwenden.Beginnen Sie mit dem Sammeln von jungen ReisBlüten aus dem Reisfeld oder einem Gewächshaus in der Meiose-Phase, um sicherzustellen, dass sie mit dem Blattmantel bedeckt sind. Wischen Sie jeden Blütenstand mit einem 70%alkoholabstrich ab und lassen Sie ihn vor dem Schneiden trocknen. Bringen Sie den Blütenstand auf eine sterile Laborbank und schneiden Sie ihn mit einer sterilisierten Schere in kleine Stücke, und übertragen Sie die Stecklinge dann auf eine Petriplatte, die NBD2-Medium enthält.Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 26 Grad Celsius für 10 bis 14 Tage, um Callus zu induzieren. Um die Transformation durchzuführen, übertragen Sie eine einzelne Kolonie von der weißen EB-Platte mit selektiven Antibiotika auf fünf Milliliter flüssiges YEB-Medium, das die gleichen Antibiotika in einem 50 Milliliter konischen sterilen Reagenzglas enthält. Schütteln Sie die Röhre auf einem Orbital-Shaker bei 250 mal g und 25 bis 28 Grad Celsius, bis Bakterien auf eine OD 600 von 0,5 wachsen.Fügen Sie einen Milliliter bakterielle Suspension zu 100 Milliliter YEB Medium mit den gleichen selektiven Antibiotika in einem 250 Milliliter konischen Kolben und schütteln Sie den Kolben auf einem Orbital-Shaker bei 250 mal g und 28 Grad Celsius für vier Stunden. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bakterien zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit DemaUM AS Medium wieder auf, und verdünnen Sie die Suspension dann auf eine OD 600 von 0,4.Sammeln Sie nach der Inkubation rund 150 gesunde hellgelbe embryogene Calli in einen 150 Milliliter sterilen Kolben. Fügen Sie 50 bis 75 Milliliter der bakteriellen Zellsuspension in den Kolben und fügen Sie dann 10 bis 25 Milliliter frisches AAM AS Medium hinzu, um den Calli für 10 bis 20 Minuten einzutauchen, gelegentlich schüttelnd. Gießen Sie die bakterielle Suspension vorsichtig aus dem Kolben und trocknen Sie die Calli mit sterilem Filterpapier, legen Sie sie dann auf eine Petrischale mit NBD AS Medium und bedecken Sie sie mit Filterpapier.Inkubieren Sie die Calli bei 25 bis 28 Grad Celsius im Dunkeln für drei Tage, überprüfen Sie sie auf bakterielles Überwuchern. Nach drei Tagen Kokultivierung die Calli mit Filterpapier auf eine sterile Petrischale übertragen und dann zwei Stunden auf einer sauberen Bank an die Luft trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Calli nicht am Filterpapier behaftet sind, und übertragen Sie sie an das primäre Auswahlmedium NBD2.Nach zwei Wochen die Calli gleichmäßig auf eine neue Platte mit frischem Selektionsmedium übertragen, dann die Calli zur Differenzierung auf frisches MS-Medium und die Triebknospen mit 10 Milligramm pro Liter Hygromycin auf MS-Medium verschieben, um mehr Triebe zu vermehren. Übertragen Sie die neuen Triebe in das halbe MS-Medium für die Wurzelinduktion und kultiieren Sie sie bei 25 bis 28 Grad Celsius unter Licht. Die transformierten Pflanzen sollten innerhalb von zwei Wochen Wurzeln produzieren.Um reproduktive Phänotyp Beobachtung durchzuführen, entfernen Sie die Paläa und Lemma aus dem Florid und Bild der ganzen Anther unter einem Stereomikroskop. Um die Lebensfähigkeit der Pollen zu beobachten, pflücken Sie reife Reisspieße vor der Blütenanthese und entfernen Sie die Paläa und das Lemma, um die Anther freizusetzen. Nehmen Sie sechs Anther und legen Sie sie auf eine Glasrutsche.Fügen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser hinzu, zerkleinern Sie den Anther mit einer Pinzette, um die Pollenkörner freizusetzen, dann fügen Sie zwei bis drei Tropfen Jodlösung hinzu und decken Sie ihn mit einem Deckelabschlag ab. Beobachten Sie das Dia unter einem Mikroskop mit niedriger Vergrößerung. Pollenkörner, die schwarz gefärbt sind, zeigen eine kräftigere Lebensfähigkeit, während Körner ohne Farbe oder die gelbbraun gefärbten verkümmert oder degeneriert sind.Um die Transverformungsmikroskopie durchzuführen, verwenden Sie 0,5% Toluidin-Blaulösung, um die Dias 30 Minuten lang zu färben, dann mit Wasser abspülen und in der Dunstabzugshaube trocknen. Nach dem Trocknen die Dias mit neutralem Baumkleber versiegeln, einen Deckelrutsch vorsichtig auf den Schlitten legen und in der Dunstabzugshaube trocknen und dann die Probe unter dem Mikroskop abbilden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine männliche sterile Linie von Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation in Reis zu schaffen.Die embryogenen Calli wurden direkt für die Umwandlung verwendet oder für die Proliferation subkultiviert, um mehr Calli für eine weitere Infektion zu erhalten. Nach 48 Stunden Mitkultivierung wurden die Calli in eine zweite Runde des Auswahlmediums verlegt. Nach 10 bis 14 Tagen zeigten transformierte Calli neu gebildete Mikrocalli, während die untransformierten Calli braun wurden und starben.Später wurden gesunde und cremig gefärbte Calli in regenerationsmittel übertragen. Der verwandelte Calli zeigte nach und nach grüne Flecken. Diese grünen Flecken wurden im Regenerationsmedium kultiviert, um das Triebwachstum zu ermöglichen, und dann in die Hälfte des MS-Mediums verschoben, um Wurzeln zu induzieren.Später wurden gesunde und kräftig wachsende Triebe mit gut entwickelten Wurzeln geerntet. Insgesamt wurden 21 regenerierte Sämlinge gewonnen. Die PCR-Verstärkung für die Hygromycin-Region zeigte, dass die Transformationshäufigkeit etwa 85,71% betrug. Die Transformationsmittel wurden genotypisiert, um die Mutationen an den sgRNA-Zielstandorten zu identifizieren.Unter den 18 transgenen Pflanzen waren acht heterozygote Linien und drei homozygote Linien CRISPR CAS9 positiv. Die homozygoten Knockout-Mutanten wurden durch grundlegende männliche Fortpflanzungsorganbeobachtung validiert. Die Anther von osabcg15 waren kleiner und blasser als die der wilden Art und es fehlten reife Pollenkörner.Transversalschnittmikroskopie wurde durchgeführt, um die anther morphologischen Defekte in osabcg15 zu untersuchen. In Stufe 10 wurden wilde Mikrosporen rund geformt und mit dunkelblau gebeiztem Exine vakant. Im Gegensatz dazu brach die osabcg15 Mikrosporen zusammen und degradierte.Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, sicherzustellen, dass sich das gesammelte Material im Meiosestadium befindet, und die Lufttrockenzeit der Calli zu steuern.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Die Leitersprosse Walking-Aufgabe: Ein Scoring-System und seine praktische Anwendung.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium- Vermitteltune unreife Embryo-Transformation von widerspenstigen Mais Inzuchtlinien mit morphogenen Genen

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...