Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר Xiaofei חן למתן תפלות אורז צעיר וסיוע בהפיכה את תרבות רקמת האורז בינוני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31900611).

1. sgRNA-CAS9 צמח ביטוי וקטור בנייה וקטורית אגרובקטריום-תיווך טרנספורמציה
<ol><li>היעד גן סטרילי זכר OsABCG15 באורז על פי הספרות שפורסמה28.</li>
	<li>עיצוב sgRNA עבור האתר המיועד הממוקם בין 106-125 bp ב exon השני של OsABCG15 (איור 1).</li>
	<li>השתמש T4 פולינוקלאוטיד קינאז כדי לסנתז ...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

מוטנטים סטריליים גבריים מלאכותיים נוצרים באופן מסורתי על ידי מוטגנזה פיזית, כימית או ביולוגית אקראית. למרות שאותם טכניקות רבות עוצמה, טבעם האקראי לא מצליח לנצל את הכמות העצומה של ידע גנומי מודרני בעל פוטנציאל לספק שיפורים מותאמים אישית ברבייה מולקולרית32. מערכת CRISPR-Cas9 שימשה ב...

אורז הוא יבול המזון החשוב ביותר, במיוחד במדינות מתפתחות, ומייצג מזון בסיסי עבור יותר ממחצית מאוכלוסיית העולם. בסך הכל, הביקוש לדגן אורז גדל והוא צפוי לגדול ב-50% עד 2030 ו-100% עד 20501,,2. שיפורים עתידיים בתפוקת אורז יצטרכו לנצל משאבים מולקולריים וגנטיים מגוונים ש הופכים את האורז למודל מצוין למחקר צמחים מונוקוטלדונים. אלה כוללים מערכת טרנספורמציה יעילה, מפה מולקולרית מתקדמת, ומסד נתונים נגיש לציבור של תגי רצף מבוטאים, אשר נוצרובמשך שנים רבות 3,4. אסטרטגיה אחת לשיפור תפוקת היבול היא ייצורזרעים היברידיים 5, מרכיב מרכזי שבו היא היכולת לתמרן את הפוריות הגברית. הבנת השליטה המולקולרית של פוריות הגבר בגידולי דגנים יכולה לעזור לתרגם ידע מפתח לטכניקות מעשיות כדי לשפר את ייצור הזרעים היברידיים ולשפראת פרודוקטיביות היבול 6,7.
טרנספורמציה גנטית היא כלי מפתח למחקר בסיסי וחקלאות מסחרית שכן היא מאפשרת הכנסת גנים זרים או מניפולציה של גנים אנדוגניים בצמחי יבול, ותוצאות יצירת קווים מהונדסים גנטית. פרוטוקול טרנספורמציה מתאים יכול לעזור להאיץ מחקרים גנטיים ומולקולריים ביולוגיה להבנה בסיסית של ויסותגנים 8. בחיידקים, טרנספורמציה גנטית מתרחשת באופן טבעי; עם זאת, בצמחים, הוא מבוצע באופן מלאכותי באמצעות טכניקות ביולוגיהמולקולרית 9,10. אגרובקטריום tumefaciens הוא קרקע נישאת, חיידק גראם שלילי הגורמים למחלת מרה הכתר בצמחים על ידי העברת T-DNA, אזור של Ti plasmid שלה, לתוך תא הצמח באמצעות מערכת הפרשת סוגIV 11,12. בצמחים, A. tumefaciens-תווך טרנספורמציה נחשבת שיטה נפוצה לשינוי גנים כי זה מוביל יציב ושילוב מספר עותק נמוך של T-DNA לתוך הגנוםהמארח 13. אורז טרנסגני נוצר לראשונה באמצעות טרנספורמציהגנטית מתווכת אגרובקטריום באמצע שנות ה־90 של המאה ה־20, ב־japonica cultivar14. באמצעות פרוטוקול זה, מספר קווים טרנסגניים הושגו בתוך תקופה של 4 חודשים עם יעילות טרנספורמציה של 10%-30%. המחקר הצביע על כך שיש שני צעדים קריטיים לטרנספורמציה המוצלחת: האחד הוא אינדוקציה של תרכובת עוברית מזרעים בוגרים והשנייה היא תוספת של acetosyringone, תרכובת פנולית, לתרבות החיידקית במהלך טיפוח שותף, המאפשר יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר בצמחים14,15. פרוטוקול זה שימש בהרחבה עם שינויים קלים japonica16,17,,18,19, כמו גם cultivars אחרים כגון indica20,21,22,,23 ו japonica טרופי,24,25. ואכן, מעל 80% מהמאמרים המתארים את טרנספורמציה אורז להשתמש אגרובקטריום-מתווכים שינוי גן ככלי13. עד כה פותחו מספר פרוטוקולי טרנספורמציה גנטית באמצעות זרעי אורז כחומר התחלתי לאינדוקציה16,,17,,18,,19. עם זאת, מעט מאוד ידוע על תפרה צעירה כמו explants לייצור יבלות. בסך הכל, חשוב להקים פרוטוקול מהיר, לשחזור ויעיל של שינוי גנים והתחדשות עבור גנומיקה תפקודית ומחקרים על שיפור היבול.
בשנים האחרונות, ההתקדמות של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 הביאה מנגנון עריכה גנומי מדויק כדי להבין את תפקוד הגנים ולספק שיפורים חשובים אגרונומית לגידולצמחים 26,27. CRISPR מציע גם הבטחה ניכרת למניפולציה של התפתחות הרבייה הגברית וייצור היברידי. במחקר זה, השתמשנו במערכת נוקאאוט גנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9 והכנסנו אותה לפרוטוקול יעיל של שינוי גן אורז באמצעות תפלות צעירות כהסברים, ובכך יצרנו קווים סטריליים יציבים לחקר התפתחות הרבייה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

עקירת הזכר היא תכונה אגרונומית חשובה לייצור זרעים היברידיים המאופיינת בדרך כלל על ידי פגמים פונקציונליים באיברי רבייה/גימטים גבריים. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 מאפשרות יעילות עריכה גבוהה ומוטציות נוקאאוט מצילות זמן של גנים של מועמדים אנדוגניים באתרים ספציפיים. בנוסף, אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה גנטית של אורז היא גם שיטת מפתח לשינוי גנים, אשר אומצה באופן נרחב על ידי מעבדות ציבוריות ופרטית רבות. במחקר זה, יישם CRISPR-Cas9 כלי עריכת הגנום ויצרנו בהצלחה שלושה קווי מוטציה סטרילי זכר על ידי עריכת גנום ממוקד של OsABCG15 ב cultivar japonica. השתמשנו בשיטת שינוי אגרובקטריום-מתווכת אורז שיכול לספק אמצעים מצוינים של סירוס גנטי לייצור זרעים היברידיים באורז. צמחים טרנסגניים ניתן להשיג בתוך 2-3 חודשים וטרנספורמטורים הומוזיגים הוקרן על ידי genotyping באמצעות ההגדלה PCR ו רצף סנגר. אפיון פנוטיפי בסיסי של קו הומוזיגוס סטרילי זכר בוצע על ידי תצפית מיקרוסקופית של איברי הרבייה זכר האורז, ניתוח קיימות אבקה על ידי יוד אשלגן יודיד (I2-KI) מכתים חצי דק חתך של anthers מתפתח.

הוכח כאן הוא השימוש בטכנולוגיית עריכת גנים כדי ליצור קו סטרילי זכר למחקר עתידי על ידי אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה גנטית באורז. כדי ליצור את הקו הסטרילי הגברי של osabcg15, CRISPR-CAS9-בתיווך mutagenesis שימש לבנייה וקטורית בינארית. SgRNA היה מונע על ידי היזם OsU3, בעוד קלטת הביטוי של hSpCas9 היה מונ?...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

עבודה זו מתארת את השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 כדי נוקאאוט גן אנדוגני OsABCG15 ואחריו Agrobacterium שונה-פרוטוקול טרנספורמציה בתיווך לייצר קו זכר סטרילי יציב באורז.

אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

תפרחות צעירות כמו explant לייצור callus חשובים לביסוס טרנספורמציה גנים מהירה ויעילה ושיטת התחדשות לחשיפת תפקוד הגנים, כמו גם לשיפור היבול. תפרחות צעירות כמו explant לייצור callus חשובים לביסוס טרנספורמציה גנים מהירה ויעילה ואת שיטת ההתחדשות לחשיפת תפקוד הגנים. הדגמת וידאו של טכניקה זו תסייע לצופה להבין את תהליך השמירה על החומרים כדי לייצר את היישור הטרנסגני הרצוי מבלי לבזבז זמן ומאמץ.התחל על ידי איסוף תפרחות אורז צעירות מהשדה אורז או חממה בשלב meiosis, לוודא שהם מכוסים נדן עלה. מנגבים כל תפרחת עם ספוגית של 70% אלכוהול ותנו לה להתייבש לפני החיתוך. מביאים את תפרחת לספסל מעבדה סטרילי וחותכים אותו לחתיכות קטנות עם מספריים מעוקרים, ואז מעבירים את החתכים לצלחת פטרי המכילה מדיום NBD2.הדגירה את הצלחת בחושך ב 26 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 14 ימים כדי לגרום קאלוס. כדי לבצע טרנספורמציה, להעביר מושבה אחת מצלחת EB לבן עם אנטיביוטיקה סלקטיבית לחמישה מיליליטר של מדיום YEB נוזלי המכיל את אותה אנטיביוטיקה במבחנה סטרילית חרוטית 50 מיליליטר. לנער את הצינור על שייקר מסלולית ב 250 פעמים g ו 25 כדי 28 מעלות צלזיוס עד חיידקים לגדול OD 600 של 0.5.הוסף מיליליטר אחד של השעיה חיידקית ל 100 מיליליטר של מדיום YEB עם אותה אנטיביוטיקה סלקטיבית בבקבוק חרוט 250 מיליליטר לנער את הבקבוק על שייקר מסלולית ב 250 פעמים g ו 28 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. צנטריפוגה התרבות ב 4, 000 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את החיידקים. השלך את supernatant ו resuspend את גלולה עם AAM כבינוני, ולאחר מכן לדלל את ההשעיה ל OD 600 של 0.4.לאחר הדגירה, לאסוף סביב 150 קאלי עוברי צהוב בהיר בריא לתוך בקבוק סטרילי 150 מיליליטר. הוסף 50 עד 75 מיליליטר של ההשעיה תא חיידקי לתוך הבקבוק ולאחר מכן להוסיף 10 עד 25 מיליליטר של טרי AAM כבינוני לטבול את קאלי במשך 10 עד 20 דקות, רועד מדי פעם. יוצקים את ההשעיה החיידקית מתוך הבקבוק בזהירות ומייבשים את הקאלי בנייר מסנן סטרילי, ואז מניחים אותם על צלחת פטרי עם NBD AS בינוני ומכסים אותם בנייר סינון.דגירה קאלי ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים, בדיקת אותם עבור צמיחת יתר חיידקית. לאחר שלושה ימים של טיפוח שותף, מעבירים את הקאלי לצלחת פטרי סטרילית באמצעות נייר סינון, ואז מייבשים אותם באוויר במשך שעתיים על ספסל נקי. ודא שהקאלי אינם דבקים בנייר הסינון והעבר אותם לבינונית הבחירה הראשית NBD2.לאחר שבועיים, להעביר את קאלי באופן שווה לצלחת חדשה המכילה מדיום בחירה טרי, ולאחר מכן להעביר את קאלי למדיום טרשת נפוצה טרי עבור בידול ואת ניצני לירות למדיום MS עם 10 מיליגרם לליטר Hygromycin להתרבות יורה יותר. העבר את היורה החדש לתוך חצי MS בינוני עבור אינדוקציה שורש ותרבות אותם תחת אור ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס. הצמחים שהשתנו צריכים לייצר שורשים בתוך שבועיים.כדי לבצע תצפית פנוטיפ הרבייה, להסיר את פלאה ולמה מן הפרחוני ותמונה anthers כולו תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי לבחון את הכדאיות אבקה, לבחור קוצים אורז בוגרת לפני אנתזת הפרח ולהסיר את פלאה ו lemma לשחרר את anthers. קח שישה אנתרים והצב אותם על מגלשת זכוכית.מוסיפים טיפה אחת של מים מזוקקים, מוחצים את האנטר עם פינצטה כדי לשחרר את גרגרי האבקה, ואז מוסיפים שתיים עד שלוש טיפות של תווי יוד ומכסים בכיסוי. שים לב לשקופית תחת מיקרוסקופ הגדלה נמוכה. גרגרי אבקה צבועים בשחור מראים כדאיות נמרצת יותר בעוד דגנים ללא צבע או אלה צבועים חום צהוב הם ננסיים או מנוונים.כדי לבצע מיקרוסקופיה חתוכת רוחבית, השתמש בתותב כחול 0.5% toluidine כדי להכתים את השקופיות במשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם במים ולייבש אותם במכסה המנוע אדים. לאחר ייבוש, לאטום את השקופיות עם דבק עץ ניטרלי, בעדינות למקם כיסוי על השקופית ולייבש אותם ברדס אדים, ואז תמונה המדגם תחת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה שימש ליצירת קו סטרילי זכר על ידי טרנספורמציה גנטית מתווך אגרובקטריום באורז.הקאלי העוברי שימש ישירות לשינוי או תת-תרבות להתרבות כדי להשיג יותר קאלי לזיהום נוסף. לאחר טיפוח שותף במשך 48 שעות, הקאלי הועברו לסיבוב שני של מדיום בחירה. לאחר 10 עד 14 ימים, הפך קאלי הראה microcalli שזה עתה נוצר בעוד קאלי untransformed הפך חום ומת.מאוחר יותר, קאלי בצבע בריא וקרמי הועברו למדיום התחדשות. הקאלי שהשתנתה הראתה בהדרגה כתמים ירוקים. כתמים ירוקים אלה היו מתורבתים במדיום התחדשות כדי לאפשר צמיחה לירות ולאחר מכן עבר חצי מדיום MS כדי לגרום לשורשים.מאוחר יותר נקצרו יריות גידול בריאות ונמרצות עם שורשים מפותחים. בסך הכל הושגו 21 שתילים מחדש. הגברה PCR עבור אזור Hygromycin הראה כי תדירות הטרנספורמציה היה כ 85.71%the transformants היו genotyped לזהות את המוטציות באתרי היעד sgRNA.בין 18 הצמחים המהודקים, שמונה קווים הטרוזיגים ושלושה קווים הומוזיגים היו CRISPR CAS9 חיובי. מוטנטים נוקאאוט הומוזיגוס אומתו על ידי התבוננות בסיסית איברי הרבייה הגבריים. אנת'רים של osabcg15 היו קטנים יותר חיוורים יותר מאלה של סוג הבר וחסר גרגרי אבקה בוגרת.מיקרוסקופיה חתך רוחבי בוצעה כדי לחקור את הפגמים מורפולוגיים אנתר ב osabcg15. בשלב 10, מיקרוספורים מסוג פראי הפכו עגולים בצורתם ו vacuolated עם exine מוכתם כחול כהה. לעומת זאת, המיקרו-ספרוס של osabcg15 התמוטט והתדרדר.בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לוודא כי החומר שנאסף נמצא בשלב meiosis ולשלוט על זמן יובש האוויר של קאלי.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

שלב בסולם הליכה משימה: שיטת הניקוד ואת היישום המעשי שלה.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...