Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere Xiaofei Chen per aver fornito le giovani infiorescenze di riso e l'assistenza nel rendere la coltura del tessuto di riso mezzo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31900611).

1. costruzione vettoriale di espressione dell'impianto sgRNA-CAS9 e trasformazione mediata da Agrobacterium
<ol><li>Mirare a un gene sterile maschio OsABCG15 nel riso secondo la letteratura pubblicata28.</li>
	<li>Progettare sgRNA per il sito di destinazione situato tra 106-125 bp nel secondo exon di OsABCG15 (Figura 1).</li>
	<li>Utilizzare la chinasi T4 polinucleotide per sintetizzare gli oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCA...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

I mutanti sterili maschili artificiali sono tradizionalmente generati da mutagenesi fisica, chimica o biologica casuale. Anche se si tratta di tecniche potenti, la loro natura casuale non riesce a capitalizzare la grande quantità di conoscenze genomiche moderne che ha il potenziale per fornire miglioramenti su misura nell'allevamentomolecolare 32. Il sistema CRISPR-Cas9 è stato ampiamente utilizzato nelle piante grazie ai suoi mezzi semplici e convenienti per manipolare e modificare il DNA<sup c...

Il riso è la più importante coltura alimentare, in particolare nei paesi in via di sviluppo, e rappresenta un alimento base per oltre la metà della popolazione mondiale. Complessivamente, la domanda di grano di riso è in crescita e si prevede un aumento del 50% entro il 2030 e del 100% entro il 20501,2. I futuri miglioramenti nella resa del riso dovranno capitalizzare su diverse risorse molecolari e genetiche che rendono il riso un modello eccellente per la ricerca sulle piante monocotyledonose. Questi includono un sistema di trasformazione efficiente, una mappa molecolare avanzata e un database accessibile al pubblico di tag di sequenza espressi, che sono stati generati nel corso dimolti anni 3,4. Una strategia per migliorare la resa delle colture è la produzione ibridadi sementi 5, un elemento centrale del quale è la capacità di manipolare la fertilità maschile. Comprendere il controllo molecolare della fertilità maschile nelle colture cerealicole può contribuire a tradurre le conoscenze chiave in tecniche pratiche per migliorare la produzione di sementi ibride e migliorare la produttivitàdelle colture 6,7.
La trasformazione genetica è uno strumento chiave per la ricerca di base e l'agricoltura commerciale in quanto consente l'introduzione di geni estranei o la manipolazione di geni endogeni nelle piante da coltura e si traduce nella generazione di linee geneticamente modificate. Un protocollo di trasformazione appropriato può contribuire ad accelerare gli studi di biologia genetica e molecolare per la comprensione fondamentale della regolazionegenica 8. Nei batteri, la trasformazione genetica avviene naturalmente; tuttavia, nelle piante, viene eseguita artificialmente utilizzando tecniche di biologia molecolare9,10. L'Agrobacterium tumefaciens è un batterio Gram-negativo trasmesso dal suolo che causa la malattia del gallo corona nelle piante trasferendo T-DNA, una regione del suo plasmide Ti, nella cellula vegetale attraverso un sistema di secrezione di tipo IV11,12. Nelle piante, la trasformazione mediata da A. tumefaciensè considerata un metodo diffuso per la modificazione genica perché porta all'integrazione stabile e a basso numero di copie del T-DNA nel genoma dell'ospite13. Il riso transgenico è stato generato per la prima volta attraverso la trasformazione genica mediata dall'Agrobacteriuma metà degli anni '90 nella cultivar japonica14. Utilizzando questo protocollo, sono state ottenute diverse linee transgeniche in un periodo di 4 mesi con un'efficienza di trasformazione del 10%-30%. Lo studio ha indicato che ci sono due fasi critiche per la trasformazione di successo: una è l'induzione del callo embrionale da semi maturi e un'altra è l'aggiunta di acetosyringone, un composto fenolico, alla coltura batterica durante la co-coltivazione, che consente una maggiore trasformazione dell'efficienza nellepiante 14,15. Questo protocollo è stato ampiamente utilizzato con piccole modifiche in japonica16,17,18,19 così come altre cultivar come indica20,21,22,23 e tropical japonica24,25. Infatti, oltre l'80% degli articoli che descrivono la trasformazione del riso utilizzano la trasformazione genica mediata dall'Agrobacteriumcome strumento13. Ad oggi, sono stati sviluppati diversi protocolli di trasformazione genetica utilizzando semi di riso come materiale di partenza per l'induzione callus16,17,18,19. Tuttavia, si sa molto poco sui giovani infiorescenza come esplicativi per la produzione di callus. Nel complesso, è importante stabilire un protocollo di trasformazione e rigenerazione genica rapido, riproducibile ed efficiente per la genomica funzionale e gli studi sul miglioramento delle colture.
Negli ultimi anni, il progresso della tecnologia CRISPR-Cas9 ha portato a un preciso meccanismo di editing del genoma per comprendere la funzione genica e fornire miglioramenti agronomiamente importanti perl'allevamento delle piante 26,27. CRISPR offre anche notevoli promesse per la manipolazione dello sviluppo riproduttivo maschile e della produzione ibrida. In questo studio, abbiamo utilizzato un sistema di knockout genico utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9 e lo abbiamo accoppiato a un protocollo efficiente di trasformazione genica del riso utilizzando le giovani infiorescenze come espiantamenti, creando così linee sterili maschili stabili per lo studio dello sviluppo riproduttivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
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agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

La sterilità maschile è un importante tratto agronomico per la produzione di semi ibridi che di solito è caratterizzata da difetti funzionali negli organi riproduttivi maschili/gameti. I recenti progressi nella tecnologia di editing del genoma CRISPR-Cas9 consentono un'elevata efficacia di editing e mutazioni di knockout per il salvataggio dei tempi di geni candidati endogeni in siti specifici. Inoltre, la trasformazione genetica mediata dall'Agrobacteriumdel riso è anche un metodo chiave per la modificazione genica, che è stato ampiamente adottato da molti laboratori pubblici e privati. In questo studio, abbiamo applicato gli strumenti di editing del genoma crispR-Cas9 e generato con successo tre linee mutanti sterili maschili dall'editing mirato del genoma di OsABCG15 in una cultivar japonica. Abbiamo utilizzato un metodo modificato di trasformazione del riso mediato da Agrobacteriumche potrebbe fornire ottimi mezzi di emasculazione genetica per la produzione ibrida di semi nel riso. Le piante transgeniche possono essere ottenute entro 2-3 mesi e i trasformatori omozigoti sono stati schermati dalla genotipazione utilizzando l'amplificazione PCR e il sequenziamento Diger. La caratterizzazione fenotipica di base della linea omozigosa sterile maschile è stata eseguita mediante l'osservazione microscopica degli organi riproduttivi maschili di riso, l'analisi della vitalità del polline mediante iodio di iodio (I2-KI) macchiando la sezione trasversale semisegnare degli anteri.

Dimostrato qui è l'uso della tecnologia di editing genico per creare una linea sterile maschile per la ricerca futura da Agrobacterium-mediato trasformazione genetica nel riso. Per creare la linea sterile maschile di osabcg15, èstata utilizzata la mutagenesi mediata CRISPR-CAS9 per la costruzione di vettori binari. Lo sgRNA è stato guidato dal promotore OsU3, mentre la cassetta di espressione di hSpCas9 è stata guidata dal doppio promotore 35S, e il vettore intermedio è stato assemblato in un unico...

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Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Questo lavoro descrive l'uso della tecnologia di editing del genoma CRISPR-Cas9 per knockout gene endogeno OsABCG15 seguita da un protocollo di trasformazione mediato Agrobacterium modificatoper produrre una linea stabile maschio-sterile nel riso.

Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Le giovani infiorescenze come espianto per la produzione di callo sono importanti per stabilire una trasformazione genica rapida ed efficiente e un metodo di rigenerazione per rivelare la funzione genica e per il miglioramento delle colture. Le giovani infiorescenze come espianto per la produzione di callo sono importanti per stabilire una trasformazione genica rapida ed efficiente e il metodo di rigenerazione per rivelare la funzione genica. La dimostrazione video di questa tecnica aiuterà lo spettatore a comprendere il processo di manutenzione dei materiali per produrre quell'allineamento transgenico desiderato senza perdere tempo e fatica.Inizia raccogliendo giovani infiorescenze di riso dalla risaia o da una serra in fase di meiosi, assicurandoti che siano coperte con la trafia fogliare. Pulire ogni infiorescenza con un tampone alcolico al 70% e lasciarla asciugare prima del taglio. Portare l'infiorescenza su un banco da laboratorio sterile e tagliarla a piccoli pezzi con forbici sterilizzate, quindi trasferire le talee su una piastra di Petri contenente mezzo NBD2.Incubare la piastra al buio a 26 gradi Celsius per 10-14 giorni per indurre il callo. Per eseguire la trasformazione, trasferire una singola colonia dalla piastra EB bianca con antibiotici selettivi a cinque millilitri di mezzo YEB liquido contenente gli stessi antibiotici in una provetta sterile conica da 50 millilitri. Agitare il tubo su uno shaker orbitale a 250 volte g e da 25 a 28 gradi Celsius fino a quando i batteri non crescono fino a un OD 600 di 0,5.Aggiungere un millilitro di sospensione batterica a 100 millilitri di mezzo YEB con gli stessi antibiotici selettivi in un pallone conico da 250 millilitri e scuotere il pallone su uno shaker orbitale a 250 volte g e 28 gradi Celsius per quattro ore. Centrifugare la coltura a 4.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente per raccogliere i batteri. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet con mezzo AAM AS, quindi diluire la sospensione in un OD 600 di 0,4.Dopo l'incubazione, raccogliere circa 150 calli embriogeni giallo chiaro sani in un pallone sterile da 150 millilitri. Aggiungere da 50 a 75 millilitri della sospensione cellulare batterica nel pallone e quindi aggiungere da 10 a 25 millilitri di mezzo AAM AS fresco per immergere il calli per 10-20 minuti, tremando di tanto in tanto. Versare la sospensione batterica fuori dal pallone con cura e asciugare il calli con carta da filtro sterile, quindi posizionarli su una piastra di Petri con mezzo NBD AS e coprirli con carta da filtro.Incubare il calli a 25-28 gradi Celsius al buio per tre giorni, controllandoli per la crescita troppo batterica. Dopo tre giorni di co-coltivazione, trasferire il calli in una piastra di Petri sterile utilizzando carta da filtro, quindi asciugarli ad aria per due ore su una panca pulita. Assicurarsi che il calli non sia rispettato alla carta filtrante e trasferirli al mezzo di selezione primario NBD2.Dopo due settimane, trasferire il calli uniformemente su una nuova piastra contenente un nuovo mezzo di selezione, quindi spostare il calli su un mezzo MS fresco per la differenziazione e le gemme di germogli su mezzo MS con 10 milligrammi per litro di igromicina per proliferare più germogli. Trasferire i nuovi germogli in mezzo mezzo mezzo MS per l'induzione delle radici e culturarli sotto la luce a 25-28 gradi Celsius. Le piante trasformate dovrebbero produrre radici entro due settimane.Per eseguire l'osservazione del fenotipo riproduttivo, rimuovere il palea e il lemma dal florido e ridire l'intero anthers al microscopio stereo. Per osservare la vitalità del polline, raccogliere le spighe di riso mature prima dell'antesi del fiore e rimuovere il palea e il lemma per rilasciare le anthers. Prendi sei anthers e mettili su uno scivolo di vetro.Aggiungere una goccia di acqua distillata, schiacciare l'anther con una pinzetta per rilasciare i grani di polline, quindi aggiungere da due a tre gocce di soluzione di iodio e coprire con un coverslip. Osservare la diapositiva al microscopio a basso ingrandimento. I grani di polline tinti di nero mostrano una vitalità più vigorosa mentre i grani senza colore o quelli tinti di giallo marrone sono stentata o degenerati.Per eseguire la microscopia di sezionamento trasversale, utilizzare la soluzione blu toluidina allo 0,5% per macchiare i vetrini per 30 minuti, quindi sciacquarli con acqua e asciugarli nella cappa dei fumi. Una volta asciutti, sigillare i vetrini con colla neutra dell'albero, posizionare delicatamente un coverslip sullo scivolo e asciugarli nel cappuccio dei fumi, quindi premere il campione al microscopio. Questo protocollo è stato utilizzato per creare una linea sterile maschile dalla trasformazione genetica mediata da Agrobacterium nel riso.I calli embriogenici sono stati utilizzati direttamente per la trasformazione o sottocolturati per la proliferazione per ottenere più calli per ulteriori infezioni. Dopo aver co-coltivato per 48 ore, i calli sono stati spostati su un secondo turno di mezzo di selezione. Dopo 10-14 giorni, calli trasformato mostrò microcalli appena formati mentre i calli non trasformati divennero marroni e morirono.Successivamente, i calli colorati sani e cremosi sono stati trasferiti in mezzo di rigenerazione. Il calli trasformato ha gradualmente mostrato macchie verdi. Queste macchie verdi sono state coltivate in mezzo di rigenerazione per consentire la crescita del germoglio e poi spostate in mezzo mezzo mezzo SM per indurre radici.Successivamente, sono stati raccolti germogli in crescita sani e vigorosi con radici ben sviluppate. In totale sono state ottenute 21 piantine rigenerate. L'amplificazione PCR per la regione della igromicina ha mostrato che la frequenza di trasformazione era di circa l'85,71%I trasformatori sono stati genotipati per identificare le mutazioni nei siti bersaglio dello sgRNA.Tra le 18 piante transgeniche, otto linee eterozigoti e tre linee omozigote erano CRISPR CAS9 positive. I mutanti knockout omozigoti sono stati convalidati dall'osservazione di base degli organi riproduttivi maschili. Gli anthers di osabcg15 erano più piccoli e più pallidi di quelli del tipo selvaggio e mancavano di grani di polline maturi.La microscopia a sezione trasversale è stata eseguita per indagare i difetti morfologici dell'ante in osabcg15. Allo stadio 10, le microspore di tipo selvatico divennero di forma rotonda e vacuolate con esine macchiata di blu scuro. Al contrario, le microspore osabcg15 sono crollate e degradate.Quando si tenta questo protocollo, è importante assicurarsi che il materiale raccolto sia in fase di meiosi e controllare il tempo di asciugatura dell'aria del calli.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

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Ricerca

Biologia

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Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

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Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Rilevamento in tempo reale della produzione di specie reattive dell'ossigeno nella risposta immunitaria nel riso con un saggio di chemiluminescenza

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...