Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne Xiaofei Chen for å gi de unge ris blomsterstander og hjelp til å gjøre risvev kultur medium. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31900611).

1. sgRNA-CAS9 plante uttrykk vektor konstruksjon og Agrobacterium-mediert transformasjon
<ol><li>Målrett mot et mannlig sterilt gen OsABCG15 i ris i henhold til publisert litteratur28.</li>
	<li>Design sgRNA for det målrettede området som ligger mellom 106-125 bp i den andre exon av OsABCG15 (Figur 1).</li>
	<li>Bruk T4 polynukleotid kinase å syntetisere sgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' og 5'sgR-OsABCG15-R: AA...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

Kunstige geniske mannlige sterile mutanter genereres tradisjonelt av tilfeldig fysisk, kjemisk eller biologisk mutagenese. Selv om dette er kraftige teknikker, klarer deres tilfeldige natur ikke å kapitalisere på den enorme mengden moderne genomisk kunnskap som har potensial til å levere skreddersydde forbedringer i molekylær avl32. CRISPR-Cas9-systemet har blitt mye brukt i planter på grunn av sine enkle og rimelige midler for å manipulere og redigere DNA29,</su...

Ris er den viktigste matavlingen, spesielt i utviklingsland, og representerer en stiftmat for over halvparten av verdens befolkning. Samlet sett øker etterspørselen etter riskorn og forventes å øke 50% innen 2030 og 100% innen 20501,,2. Fremtidige forbedringer i risutbyttet må kapitalisere på ulike molekylære og genetiske ressurser som gjør ris til en utmerket modell for monocotyledonous planteforskning. Disse inkluderer et effektivt transformasjonssystem, avansert molekylært kart og offentlig tilgjengelig database med uttrykte sekvenskoder, som har blitt generert over mangeår 3,,4. En strategi for å forbedre avlingsutbyttet er hybridfrøproduksjon 5,et sentralt element som er evnen til å manipulere mannlig fruktbarhet. Forstå molekylær kontroll av mannlig fruktbarhet i kornavlinger kan bidra til å oversette viktig kunnskap til praktiske teknikker for å forbedre hybrid frø produksjon og forbedre avling produktivitet6,,7.
Genetisk transformasjon er et viktig verktøy for grunnleggende forskning og kommersielt landbruk siden det muliggjør innføring av fremmede gener eller manipulering av endogene gener i avlingsplanter, og resulterer i generering av genmodifiserte linjer. En passende transformasjonsprotokoll kan bidra til å akselerere genetiske og molekylærbiologistudier for grunnleggende forståelse av genregulering8. I bakterier foregår genetisk transformasjon naturlig; men i planter utføres det kunstig ved hjelp av molekylærbiologiteknikker 9,10. Agrobacterium tumefaciens er en jordbåren, Gram-negativ bakterie som forårsaker krone gallesykdom i planter ved å overføre T-DNA, en region av sin Ti plasmid, inn i plantecellen via et type IV sekresjonssystem11,12. I planter anses A. tumefaciens-mediert transformasjon som en utbredt metode for genmodifisering fordi det fører til stabil og lav kopinummerintegrasjon av T-DNA i vertsgenomet13. Transgen ris ble først generert gjennom Agrobacterium-mediert gentransformasjon på midten av 1990-tallet i japonica sorti14. Ved hjelp av denne protokollen ble flere transgene linjer oppnådd i løpet av en periode på 4 måneder med en transformasjonseffektivitet på 10%-30%. Studien indikerte at det er to kritiske skritt for vellykket transformasjon: en er induksjon av embryogen callus fra modne frø og en annen er tillegg av acetosyringone, en fenolisk forbindelse, til bakteriekulturen under samtidig dyrking, noe som gir høyere transformasjonseffektivitet iplanter 14,15. Denne protokollen har blitt mye brukt med mindre endringer i japonica16,,17,,18,,19 samt andre sorter som indica20,,21,,22,,23 og tropisk japonica24,25. Faktisk bruker over 80% av artiklene som beskriver ristransformasjon Agrobacterium-mediert gentransformasjon som et verktøy13. Til dags dato har flere genetiske transformasjonsprotokoller blitt utviklet ved hjelp av risfrø som startmateriale for callus induksjon16,17,18,19. Imidlertid er svært lite kjent om unge blomsterstand som explants for callus produksjon. Samlet sett er det viktig å etablere en rask, reproduserbar og effektiv gentransformasjons- og regenereringsprotokoll for funksjonell genomikk og studier på avlingsforbedring.
De siste årene har utviklingen av CRISPR-Cas9-teknologi resultert i en presis genomredigeringsmekanisme for å forstå genfunksjonen og levere agronomisk viktige forbedringer forplanteavl 26,27. CRISPR gir også et betydelig løfte om manipulering av mannlig reproduktiv utvikling og hybridproduksjon. I denne studien benyttet vi et genutslagssystem ved hjelp av CRISPR-Cas9-teknologi og opprettet det til en effektiv risgentransformasjonsprotokoll ved hjelp av unge blomsterstander som explants, og dermed skape stabile mannlige sterile linjer for studiet av reproduktiv utvikling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

Mannlig sterilitet er en viktig agronomisk egenskap for hybrid frøproduksjon som vanligvis er preget av funksjonelle defekter i mannlige reproduktive organer / gametes. Nylige fremskritt innen CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi gir høy redigeringseffekt og tidsbesparende knockoutmutasjoner av endogene kandidatgener på bestemte steder. I tillegg er Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon av ris også en viktig metode for genmodifisering, som har blitt mye vedtatt av mange offentlige og private laboratorier. I denne studien brukte vi CRISPR-Cas9 genomredigeringsverktøy og genererte vellykket tre mannlige sterile mutantlinjer ved målrettet genomredigering av OsABCG15 i en japonica-sort. Vi brukte en modifisert Agrobacterium-mediert ris transformasjon metode som kan gi gode midler for genetisk emasculation for hybrid frø produksjon i ris. Transgene planter kan oppnås innen 2–3 måneder, og homozygøse transformanter ble screenet ved å genotyping ved hjelp av PCR-forsterkning og Sanger-sekvensering. Grunnleggende fenotypisk karakterisering av den mannlige sterile homozygous linjen ble utført ved mikroskopisk observasjon av ris mannlige reproduktive organer, pollen levedyktighet analyse av jod kaliumjodid (I2-KI) farging semi-tynn tverrsnitt av utviklende anthers.

Demonstrert her er bruk av genredigeringsteknologi for å skape en mannlig steril linje for fremtidig forskning av Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon i ris. For å lage den mannlige sterile linjen av osabcg15,ble CRISPR-CAS9-mediert mutagenese brukt til binær vektorkonstruksjon. SgRNA ble drevet av OsU3-promotoren, mens uttrykkskassetten til hSpCas9 ble drevet av den doble 35S-promotoren, og den midterste vektoren ble satt sammen i en enkelt binær vektor pCAMBIA1300 designet for <e...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Dette arbeidet beskriver bruken av CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi for å slå ned endogene genet OsABCG15 etterfulgt av en modifisert Agrobacterium-medierttransformasjonsprotokoll for å produsere en stabil mannssteril linje i ris.

Agrobacterium-Mediert genetisk transformasjon, transgen produksjon, og dens anvendelse for studiet av mannlig reproduktiv utvikling i ris

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Unge blomsterstander som explant for callusproduksjon er viktig for å etablere en rask og effektiv gentransformasjon og en regenereringsmetode for å avsløre genfunksjon så vel som for avlingsforbedring. Unge blomsterstander som explant for callusproduksjon er viktig for å etablere en rask og effektiv gentransformasjon og regenereringsmetoden for å avsløre genfunksjon. Videodemonstrasjon av denne teknikken vil hjelpe betrakteren å forstå prosessen med å opprettholde materialene for å produsere den ønskede transgene justere uten å kaste bort tid og krefter.Begynn med å samle unge risflorescences fra rismarken eller et drivhus på meiosestadiet, og sørg for at de er dekket med bladhylsen. Tørk hver blomstrescence med en 70% spritserviett og la den tørke før du kutter. Ta blomsterstanden til en steril laboratoriebenk og skjær den i små biter med sterilisert saks, og overfør deretter borekaklingene til en Petri-plate som inneholder NBD2-medium.Inkuber platen i mørket ved 26 grader Celsius i 10 til 14 dager for å indusere callus. For å utføre transformasjon, overfør en enkelt koloni fra den hvite EB-platen med selektiv antibiotika til fem milliliter flytende YEB-medium som inneholder de samme antibiotika i et 50 milliliter konisk sterilt reagensrør. Rist røret på en orbital shaker på 250 ganger g og 25 til 28 grader Celsius til bakterier vokser til en OD 600 av 0,5.Tilsett en milliliter bakteriell suspensjon til 100 milliliter YEB medium med samme selektive antibiotika i en 250 milliliter konisk kolbe og rist kolben på en orbital shaker på 250 ganger g og 28 grader Celsius i fire timer. Sentrifuger kulturen på 4000 g i 10 minutter ved romtemperatur for å samle bakteriene. Kast den overnaturlige og resuspend pellet med AAM AS medium, og fortynne deretter suspensjonen til en OD 600 av 0,4.Etter inkubasjonen, samle rundt 150 sunt lys gul embryogen calli i en 150 milliliter steril kolbe. Tilsett 50 til 75 milliliter av bakteriell cellesuspensjon i kolben og legg deretter til 10 til 25 milliliter friskT AAM AS medium for å senke calli i 10 til 20 minutter, rist av og til. Hell bakteriefjæringen forsiktig ut av kolben og tørk callien med sterilt filterpapir, legg dem deretter på en petriskål med NBD AS medium og dekk dem med filterpapir.Inkuber calli på 25 til 28 grader Celsius i mørket i tre dager, sjekke dem for bakteriell overvekst. Etter tre dager med co-dyrking, overføre calli til en steril Petri skål ved hjelp av filterpapir, deretter luft tørke dem i to timer på en ren benk. Kontroller at calli ikke følges filterpapiret og overfører dem til det primære utvalgsmediet NBD2.Etter to uker, overføre calli jevnt til en ny plate som inneholder ferskt utvalg medium, deretter flytte calli til frisk MS medium for differensiering og skyte knopper til MS medium med 10 milligram per liter Hygromycin å spre flere skudd. Overfør de nye skuddene til halvparten MS medium for rotinduksjon og kultur dem under lys på 25 til 28 grader Celsius. De forvandlede plantene skal produsere røtter innen to uker.For å utføre reproduktiv fenotypeobservasjon, fjern palea og lemma fra blomstrende og bilde hele anthers under et stereomikroskop. For å observere pollen levedyktighet, velg modne ris pigger før blomsten antese og fjerne palea og lemma å frigjøre anthers. Ta seks anthers og plasser dem på en glasssklie.Tilsett en dråpe destillert vann, knus anther med pinsett for å frigjøre pollenkornene, og legg deretter til to til tre dråper jodoppløsning og dekk med en dekkslip. Vær oppmerksom på lysbildet under et mikroskop med lav forstørrelse. Pollen korn farget svart viser mer kraftig levedyktighet mens korn uten farge eller de farget gul brun er forkrøplet eller degenerert.For å utføre tverrgående snitting mikroskopi, bruk 0,5% toluidin blå løsning for å flekke lysbildene i 30 minutter, skyll dem deretter med vann og tørk dem i røykhetten. Når de er tørre, forsegler du lysbildene med nøytralt trelim, plasserer forsiktig en dekkslips på lysbildet og tørker dem i røykhetten, og deretter bilde prøven under et mikroskop. Denne protokollen ble brukt til å lage en mannlig steril linje av Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon i ris.Den embryogene calli ble direkte brukt for transformasjon eller subkulturert for spredning for å få mer calli for videre infeksjon. Etter å ha dyrket i 48 timer, ble calli flyttet til en andre runde med utvalgsmedium. Etter 10 til 14 dager viste forvandlet calli nydannet microcalli mens den uoverførte calli ble brun og døde.Senere ble sunn og kremet farget calli overført til regenereringsmedium. Den forvandlede calli viste gradvis grønne flekker. Disse grønne flekkene ble dyrket i regenereringsmedium for å tillate skuddvekst og deretter flyttet til halvparten MS medium for å indusere røtter.Senere ble sunne og kraftig voksende skudd med velutviklede røtter høstet. Totalt ble det oppnådd 21 regenererte frøplanter. PCR-forsterkning for Hygromycin-regionen viste at transformasjonsfrekvensen var ca. 85,71 %Transformantene ble genotypert for å identifisere mutasjonene på sgRNA-målstedene.Blant de 18 transgene plantene var åtte heterozygous linjer og tre homozygous linjer CRISPR CAS9 positive. De homozygøse knockoutmutantene ble validert av grunnleggende mannlig reproduktiv organobservasjon. Anthers av osabcg15 var mindre og blekere enn de av vill type og manglet modne pollen korn.Tverrgående snitting av mikroskopi ble utført for å undersøke anther morfologiske defekter i osabcg15. På trinn 10 ble wild-type mikrosporer runde formet og vacuolated med mørk blå farget exine. I motsetning kollapset osabcg15 mikrosporene og forringes.Når du prøver denne protokollen, er det viktig å sikre at det innsamlede materialet er i meiosis stadium og for å kontrollere den lufttørre tiden til calli.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisering og utnyttelse av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediert Transient Protein Produksjonen i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgen Gnagere analyse for Kvantifisering Mann Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

En flerhulls kryoampulle Eliminerer Frysing Arti når muskelvev er direkte nedsenket i flytende nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediert Immature Embryo Transformasjon av Recalcitrant Maize Innavlede linjer ved hjelp av morfonisk gener

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Sanntidsdeteksjon av reaktiv oksygenartsproduksjon i immunrespons i ris med en kjemiluminescensanalyse

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...