Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Os autores gostariam de reconhecer Xiaofei Chen por fornecer as inflorescências de arroz jovens e assistência para tornar a cultura do tecido de arroz meio. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31900611).

1. construção vetorial de expressão vegetal sgRNA-CAS9 e transformação mediada por Agrobacterium
<ol><li>Alvo de um gene estéril masculino OsABCG15 em arroz de acordo com a literatura publicada28.</li>
	<li>Design sgRNA para o local alvo localizado entre 106-125 bp no segundo exon de OsABCG15 (Figura 1).</li>
	<li>Use a quinase de polinucleotídeo T4 para sintetizar os oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCCCTCAAGGGGAT3' e 5 ...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

Mutantes estéreis artificiais machos são tradicionalmente gerados por mutagênese física, química ou biológica aleatória. Embora sejam técnicas poderosas, sua natureza aleatória não consegue capitalizar a vasta quantidade de conhecimento genômico moderno que tem o potencial de proporcionar melhorias personalizadas na reprodução molecular32. O sistema CRISPR-Cas9 tem sido amplamente utilizado em plantas devido aos seus meios simples e acessíveis para manipular e editar DNA<sup class="x...

O arroz é a cultura alimentar mais importante, particularmente nos países em desenvolvimento, e representa um alimento básico para mais da metade da população mundial. No geral, a demanda por grãos de arroz está crescendo e deve aumentar 50% até 2030 e 100% até 20501,2. Melhorias futuras no rendimento do arroz precisarão capitalizar em diversos recursos moleculares e genéticos que fazem do arroz um excelente modelo para pesquisa de plantas monocotíces. Estes incluem um sistema de transformação eficiente, mapa molecular avançado e banco de dados de sequência expressa, que foram gerados ao longo de muitos anos3,4. Uma estratégia para melhorar o rendimento das culturas é a produção de sementeshíbridas 5, um elemento central do qual é a capacidade de manipular a fertilidade masculina. Compreender o controle molecular da fertilidade masculina nas culturas de cereais pode ajudar a traduzir conhecimentos-chave em técnicas práticas para melhorar a produção de sementes híbridas e aumentar a produtividade das culturas6,,7.
A transformação genética é uma ferramenta fundamental para a pesquisa básica e a agricultura comercial, uma vez que permite a introdução de genes estrangeiros ou manipulação de genes endógenos em plantas agrícolas, e resulta na geração de linhas geneticamente modificadas. Um protocolo de transformação adequado pode ajudar a acelerar os estudos de biologia genética e molecular para a compreensão fundamental da regulação genética8. Nas bactérias, a transformação genética ocorre naturalmente; no entanto, nas plantas, é realizado artificialmente utilizando técnicas de biologia molecular9,10. Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria gram-negativa que causa a doença da gárbia da coroa nas plantas através da transferência de T-DNA, uma região de seu plasmídeo Ti, para a célula vegetal através de um sistema de secreção tipo IV11,12. Nas plantas, a transformação mediada por A. tumefaciensé considerada um método generalizado para modificação genética porque leva à integração estável e de baixo número de cópia do T-DNA no genoma hospedeiro13. O arroz transgênico foi gerado pela primeira vez através da transformação genética mediada pela Agrobacteriumem meados da década de 1990 na cultivar japonica14. Por meio desse protocolo, várias linhas transgênicas foram obtidas em um período de 4 meses com uma eficiência de transformação de 10% a 30%. O estudo indicou que há dois passos críticos para a transformação bem sucedida: um é a indução do calo embrionário de sementes maduras e outro é a adição de acetossiingona, um composto fenólico, à cultura bacteriana durante o coculoculto, o que permite maior transformação nas plantas14,15. Este protocolo tem sido amplamente utilizado com pequenas alterações na japonica16,,17,,18,,19, bem como outras cultivares como indica20,,21,,22,23 e japonicatropical24,25. De fato, mais de 80% dos artigos que descrevem a transformação do arroz utilizam a transformação genética mediada pelo Agrobacteriumcomo ferramenta13. Até o momento, vários protocolos de transformação genética foram desenvolvidos utilizando sementes de arroz como material inicial para indução calos16,17,18,,19. No entanto, muito pouco se sabe sobre a inflorescência jovem como explantas para a produção de calo. No geral, é importante estabelecer um protocolo de transformação e regeneração genética rápido, reprodutível e eficiente para genômica funcional e estudos sobre melhoria das culturas.
Nos últimos anos, o avanço da tecnologia CRISPR-Cas9 resultou em um mecanismo preciso de edição de genomas para entender a função genética e proporcionar melhorias agronomicamente importantes para a criação de plantas26,27. A CRISPR também oferece uma promessa considerável para a manipulação do desenvolvimento reprodutivo masculino e da produção híbrida. Neste estudo, utilizamos um sistema de eliminação genética usando a tecnologia CRISPR-Cas9 e o unimos a um protocolo eficiente de transformação de genes de arroz usando inflorescências jovens como explantas, criando assim linhas estéreis masculinas estáveis para o estudo do desenvolvimento reprodutivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

A esterilidade masculina é um importante traço agronômico para a produção de sementes híbridas que geralmente é caracterizada por defeitos funcionais em órgãos reprodutivos/gametas masculinos. Os recentes avanços na tecnologia de edição de genomas CRISPR-Cas9 permitem alta eficácia de edição e mutações de eliminação de tempo de genes candidatos endógenos em locais específicos. Além disso, a transformação genética mediada pelo agrobacteriumdo arroz também é um método-chave para a modificação genética, que tem sido amplamente adotada por muitos laboratórios públicos e privados. Neste estudo, aplicamos ferramentas de edição de genomas CRISPR-Cas9 e geramos com sucesso três linhas mutantes estéreis masculinas por edição de genoma direcionado de OsABCG15 em uma cultivar japonica. Utilizamos um método modificado de transformação de arroz mediado por Agrobacteriumque poderia fornecer excelentes meios de emasculação genética para a produção de sementes híbridas no arroz. Plantas transgênicas podem ser obtidas dentro de 2-3 meses e transformadores homozigos foram rastreados por genotipagem usando amplificação PCR e sequenciamento Sanger. A caracterização fenotípica básica da linha homozigosa estéril masculina foi realizada pela observação microscópica dos órgãos reprodutivos machos do arroz, análise de viabilidade do pólen por iodida de potássio iodo (I2-KI) manchando semi-fina seção transversal de anthers em desenvolvimento.

Demonstrado aqui o uso da tecnologia de edição de genes para criar uma linha masculina estéril para futuras pesquisas da Agrobacterium- transformação genética mediada em arroz. Para criar a linha masculina estéril de osabcg15,a mutagênese mediada pelo CRISPR-CAS9 foi usada para a construção de vetores binários. O sgRNA foi conduzido pelo promotor osU3, enquanto o de expressão de hSpCas9 foi impulsionado pelo promotor duplo 35S, e o vetor médio foi montado em um único vetor binário pCA...

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Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Este trabalho descreve o uso da tecnologia de edição de genomas CRISPR-Cas9 para eliminar o gene endógeno OsABCG15 seguido por um protocolo de transformação modificado agrobacterium mediadopara produzir uma linha estável masculino-estéril no arroz.

Agrobacterium-Transformação Genética Mediada, Produção Transgênica e Sua Aplicação para o Estudo do Desenvolvimento Reprodutivo Masculino no Arroz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

As inflorescências jovens como explantamento para a produção de calos são importantes para estabelecer uma transformação genética rápida e eficiente e um método de regeneração para revelar a função genética, bem como para a melhoria das culturas. Inflorescências jovens como explant para a produção de calos são importantes para estabelecer uma rápida e eficiente transformação genética e o método de regeneração para revelar a função genética. A demonstração em vídeo desta técnica ajudará o espectador a entender o processo de manutenção dos materiais para produzir aquele alinhado transgênico desejado sem perder tempo e esforço.Comece coletando inflorescências de arroz jovem do campo de pastagem ou de uma estufa na fase de meiose, certificando-se de que eles estão cobertos com a baia de folhas. Limpe cada inflorescência com um cotonete de 70% de álcool e deixe secar antes de cortar. Leve a inflorescência para um banco de laboratório estéril e corte-a em pequenos pedaços com uma tesoura esterilizada, em seguida, transfira as estacas para uma placa de Petri contendo meio NBD2.Incubar a placa no escuro a 26 graus Celsius por 10 a 14 dias para induzir calo. Para realizar a transformação, transfira uma única colônia da placa EB branca com antibióticos seletivos para cinco mililitros de meio YEB líquido contendo os mesmos antibióticos em um tubo de ensaio estéril cônico de 50 mililitros. Agite o tubo em um agitador orbital a 250 vezes g e 25 a 28 graus Celsius até que as bactérias cresçam para um OD 600 de 0,5.Adicione um mililitro de suspensão bacteriana a 100 mililitros de meio YEB com os mesmos antibióticos seletivos em um frasco cônico de 250 mililitros e agite o frasco em um agitador orbital a 250 vezes g e 28 graus Celsius por quatro horas. Centrifugar a cultura a 4.000 g por 10 minutos à temperatura ambiente para coletar as bactérias. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota com a média AAM AS, em seguida, dilua a suspensão para um OD 600 de 0,4.Após a incubação, colete cerca de 150 cali embriogênico amarelo claro saudável em um frasco estéril de 150 mililitros. Adicione 50 a 75 mililitros da suspensão celular bacteriana no frasco e adicione 10 a 25 mililitros de meio AAM AS fresco para imergir o cali por 10 a 20 minutos, tremendo ocasionalmente. Despeje a suspensão bacteriana do frasco cuidadosamente e seque o caldo com papel filtro estéril, em seguida, coloque-os em uma placa de Petri com meio NBD AS e cubra-os com papel filtro.Incubar o cali a 25 a 28 graus Celsius no escuro por três dias, verificando-os quanto o crescimento bacteriano. Após três dias de co-cultivo, transfira o cali para uma placa de Petri estéril usando papel filtro, depois seque-os por duas horas em um banco limpo. Certifique-se de que o calli não seja aderido ao papel do filtro e transfira-os para o meio de seleção primária NBD2.Depois de duas semanas, transfira o calli uniformemente para uma nova placa contendo meio de seleção fresco, em seguida, mova o cali para o meio ms fresco para diferenciação e os brotos de tiro para ms médio com 10 miligramas por litro Hygromiccin para proliferar mais brotos. Transfira os novos brotos para meio MS para indução de raiz e culta-os sob luz a 25 a 28 graus Celsius. As plantas transformadas devem produzir raízes dentro de duas semanas.Para realizar a observação do fenótipo reprodutivo, remova a palea e a lemma do florido e imagem de todos os anteros sob um microscópio estéreo. Para observar a viabilidade do pólen, escolha espinhos de arroz maduros antes da anestesia da flor e remova a palea e a lemma para liberar os antenos. Pegue seis anteras e coloque-os em um escorregador de vidro.Adicione uma gota de água destilada, esmague o antero com pinças para liberar os grãos de pólen, em seguida, adicione duas a três gotas de solução de iodo e cubra com uma tampa. Observe o slide sob um microscópio de baixa ampliação. Grãos de pólen tingidos preto mostram viabilidade mais vigorosa, enquanto grãos sem cor ou aqueles marrom amarelo tingido são atrofiados ou degenerados.Para realizar a microscopia transversal de secção, use uma solução azul de toluidina de 0,5% para colorar os slides por 30 minutos e enxágüe-os com água e seque-os na capa de fumaça. Uma vez seco, sele os slides com cola de árvore neutra, coloque delicadamente uma mancha de cobertura no slide e seque-os no capô da fumaça, em seguida, imagem a amostra sob um microscópio. Este protocolo foi usado para criar uma linha masculina estéril pela transformação genética mediada pela Agrobacterium no arroz.Os cali embrionários foram utilizados diretamente para a transformação ou subcultos para proliferação para obter mais cali para infecção posterior. Após co-cultivar por 48 horas, os calli foram transferidos para uma segunda rodada de seleção. Após 10 a 14 dias, calli transformado mostrou microcalli recém-formado enquanto o calli não formado ficou marrom e morreu.Posteriormente, cali de cor saudável e cremosa foram transferidos para o meio de regeneração. Os calli transformados mostraram gradualmente manchas verdes. Esses pontos verdes foram cultivados em meio de regeneração para permitir o crescimento de brotos e, em seguida, mudaram para meio MS médio para induzir raízes.Mais tarde, foram colhidas brotos saudáveis e vigorosos de cultivo com raízes bem desenvolvidas. No total, foram obtidas 21 mudas regeneradas. Amplificação do PCR para a região da Higromicina mostrou que a frequência de transformação foi de aproximadamente 85,71% Os transformadores foram genótipos para identificar as mutações nos locais alvo do sgRNA.Entre as 18 plantas transgênicas, oito linhas heterozigous e três linhas homozigos foram CRISPR CAS9 positivas. Os mutantes homozigos foram validados pela observação básica de órgãos reprodutivos masculinos. Os anthers de osabcg15 eram menores e mais pálidos do que os do tipo selvagem e não tinham grãos maduros de pólen.A microscopia transversal foi realizada para investigar os defeitos morfológicos anteros em osabcg15. No estágio 10, microsporos do tipo selvagem tornaram-se em forma redonda e vacuolados com exina manchada azul escuro. Em contraste, os microsporos osabcg15 entraram em colapso e degradaram.Ao tentar esse protocolo, é importante garantir que o material coletado esteja em fase de meiose e controlar o tempo seco do caldo.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

O Ladder Rung Walking Tarefa: um sistema de pontuação e sua aplicação prática.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Transplante de lente em Zebrafish e sua Aplicação na Análise de Mutantes Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

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Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Assay silenciamento gênico Em Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgênicos Rodent Ensaio para Quantificação celular germinativas masculinas Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Transformação de embrião imaturo mediado de linhas de milho recalcitrante usando genes morfogênicos

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...