Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить Xiaofei Чэнь для предоставления молодых соцветий риса и помощь в создании рисовой ткани культуры среды. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31900611).

1. sgRNA-CAS9 конструкция вектора выражения завода и Agrobacterium-опосредованнаятрансформация
<ol><li>Целевой мужской стерильный ген OsABCG15 в рисе в соответствии с опубликованнойлитературой 28.</li>
	<li>Дизайн sgRNA для целевого сайта, расположенного между 106-125 bp во втором exon OsABCG15</...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

Искусственные генные мужские стерильные мутанты традиционно генерируются случайным физическим, химическим или биологическим мутагенезом. Хотя это мощные методы, их случайный характер не может извлечь выгоду из огромного количества современных геномных знаний, которые имеют потенци...

Рис является наиболее важной продовольственной культурой, особенно в развивающихся странах, и представляет собой основной продукт питания для более чем половины населения мира. В целом спрос на рисовое зерно растет и, по прогнозируется, увеличится на 50% к 2030 году и на 100% к 2050году 1,,2. Будущие улучшения урожайности риса должны будут извлечь выгоду из различных молекулярных и генетических ресурсов, которые делают рис отличной моделью для монокотайледонных исследований растений. К ним относятся эффективная система трансформации, передовая молекулярная карта и общедоступная база данных тегов выраженной последовательности, которые были созданыв течение многих лет 3,4. Одной из стратегий повышения урожайности является гибридноепроизводство семян 5,центральным элементом которого является способность манипулировать мужской плодовитости. Понимание молекулярного контроля мужской плодовитости зерновых культур может помочь перевести ключевые знания в практические методы для улучшения производства гибридных семян и повышенияурожайности 6,,7.
Генетическая трансформация является ключевым инструментом для фундаментальных исследований и коммерческого сельского хозяйства, поскольку она позволяет внедрение иностранных генов или манипуляции эндогенных генов в растениеводствах, и приводит к генерации генетически модифицированных линий. Соответствующий протокол преобразования может помочь ускорить генетические и молекулярные исследования биологии для фундаментального понимания регуляциигенов 8. У бактерий генетическая трансформация происходит естественным путем; однако, в растениях, это выполняется искусственно с использованием методов молекулярнойбиологии 9,10. Agrobacterium tumefaciens является почвенной, грам-негативной бактерией, которая вызывает заболевания коронного желчного пузыря у растений, передавая T-DNA, область его плазмида Ti, в клетку растений через систему секреции типа IV11,12. В растениях, A. tumefaciens-опосредованное преобразование считается широко распространенным методом для модификации генов, поскольку это приводит к стабильной и низкой интеграции числа копий Т-ДНКв геном хозяина 13. Трансгенный рис был впервые создан через Agrobacterium-опосредованноепреобразование гена в середине 1990-х годов в japonica cultivar14. С помощью этого протокола в течение 4 месяцев было получено несколько трансгенных линий с эффективностью трансформации от 10%до 30%. Исследование показало, что есть два критических шага для успешной трансформации: один является индукция эмбрионального каллуса из зрелых семян, а другой является добавление ацетосиренгона, фенольное соединение, к бактериальной культуре во время совместного выращивания, что позволяет более высокую эффективность преобразованияв растениях 14,15. Этот протокол был широко использован с незначительными изменениями в japonica16,17,18,19, а также другие сорта, такие как indica20,21,22,23 и тропические japonica24,,25. Действительно, более 80% статей, описывающих преобразование риса использовать Agrobacterium-опосредованноепреобразование генов в качестве инструмента13. На сегодняшний день разработано несколько протоколов генетической трансформации с использованием семян риса в качестве исходного материаладля индукции каллуса 16,,17,,18,,19. Тем не менее, очень мало известно о молодых соцветий, как explants для производства каллуса. В целом, важно создать быстрый, воспроизводимый и эффективный протокол преобразования генов и регенерации для функциональной геномики и исследований по улучшению урожая.
В последние годы развитие технологии CRISPR-Cas9 привело к точному механизму редактирования генома, чтобы понять функцию генов и доставить агрономически важные улучшениядля разведения растений 26,27. CRISPR также предлагает значительные перспективы для манипулирования мужским репродуктивным развитием и гибридным производством. В этом исследовании мы использовали систему генного нокаута с использованием технологии CRISPR-Cas9 и соединили ее с эффективным протоколом преобразования генов риса, используя молодые соцветия в качестве эксплантов, создавая тем самым стабильные мужские стерильные линии для изучения репродуктивного развития.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

Мужская стерильность является важной агрономической чертой для производства гибридных семян, которая обычно характеризуется функциональными дефектами в мужских репродуктивных органах/геймерах. Последние достижения в области технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 позволяют обеспечить высокую эффективность редактирования и временем для мутаций эндогенных генов-кандидатов на конкретных участках. Кроме того, Agrobacterium-опосредованная генетическая трансформация риса также является ключевым методом модификации генов, который был широко принят многими государственными и частными лабораториями. В этом исследовании мы применили инструменты редактирования генома CRISPR-Cas9 и успешно создали три мужские стерильные линии мутантов путем целевого редактирования генома OsABCG15 в japonica cultivar. Мы использовали модифицированный метод преобразования риса при посредничестве Agrobacterium,который мог бы обеспечить отличные средства генетической выхолощения для производства гибридных семян риса. Трансгенные растения могут быть получены в течение 2-3 месяцев и гомозиготные трансформанты были проверены генотипированием с использованием усиления ПЦР и секвенирования Sanger. Базовая фенотипическая характеристика мужской стерильной гомозиготной линии была выполнена микроскопическим наблюдением за рисовыми мужскими репродуктивными органами, анализом жизнеспособности пыльцы йодным йодом калия (I2-KI),окрашивая полутонкое поперечное сечение развивающихся пыль.

Здесь демонстрируется использование технологии редактирования генов для создания мужской стерильной линии для будущих исследований Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации риса. Для создания мужской стерильной линии osabcg15, CRISPR-CAS9-опосредованного мутагенеза был и?...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Эта работа описывает использование технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 для нокаутирования эндогенного гена OsABCG15 с последующим модифицированным протоколом трансформации Agrobacterium-опосредованногодля производства стабильной мужской стерильной линии в рисе.

Agrobacterium-Опосредованная генетическая трансформация, трансгенное производство и его применение для изучения репродуктивного развития мужчин в рисе

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Молодые соцветия, как explant для производства каллуса имеют важное значение для создания быстрой и эффективной трансформации генов и метод регенерации для выявления функции гена, а также для улучшения урожая. Молодые соцветия как эксплант для производства каллуса имеют важное значение для создания быстрой и эффективной трансформации генов и метода регенерации для выявления функции генов. Видео демонстрация этой техники поможет зрителю понять процесс поддержания материалов для производства желаемого трансгенного выравнивания, не теряя времени и усилий.Начните с сбора молодых соцветий риса из рисового поля или теплицы на стадии мейоза, убедившись, что они покрыты листом оболочки. Протрите каждую соцветие с 70% спиртового тампона и дайте ему высохнуть перед резки. Принесите соцветие на стерильную скамейку лаборатории и разрежьте его на мелкие кусочки с стерилизованными ножницами, а затем перенесите черено на пластину Петри, содержащую NBD2 среды.Инкубировать пластину в темноте при 26 градусах по Цельсию в течение 10 до 14 дней, чтобы вызвать каллуса. Для выполнения трансформации перенесите одну колонию из белой пластины EB с селективными антибиотиками в пять миллилитров жидкой среды YEB, содержащей те же антибиотики в 50 миллилитровой конической стерильной пробирке. Встряхните трубку на орбитальном шейкере в 250 раз г и от 25 до 28 градусов по Цельсию, пока бактерии не вырастут до OD 600 из 0,5.Добавьте один миллилитр бактериальной суспензии в 100 миллилитров среды YEB с теми же селективными антибиотиками в конической колбе 250 миллилитров и встряхните колбу на орбитальном шейкере при 250 раз g и 28 градусах Цельсия в течение четырех часов. Центрифуга культуры на 4000 г в течение 10 минут при комнатной температуре для сбора бактерий. Отбросьте супернатант и повторно посовепайте гранулы со средой AAM AS, затем разбавьте подвеску до OD 600 из 0.4.После инкубации соберите около 150 здоровых светло-желтых эмбриональных калли в стерильную колбу на 150 миллилитров. Добавить от 50 до 75 миллилитров бактериальной клеточной суспензии в колбу, а затем добавить от 10 до 25 миллилитров свежих AAM AS среды, чтобы погрузить калли в течение 10 до 20 минут, встряхивая время от времени. Налейте бактериальную суспензию из колбы тщательно и высушите калли стерильной фильтровальной бумагой, затем поместите их на чашку Петри со средой NBD AS и накройте их фильтровальной бумагой.Инкубировать калли при 25 до 28 градусов по Цельсию в темноте в течение трех дней, проверяя их на бактериальный разрастание. После трех дней совместного выращивания, перенесите калли в стерильную чашку Петри с помощью фильтровальной бумаги, затем высушите их в течение двух часов на чистой скамейке. Убедитесь, что калли не привязаны к фильтровальной бумаге и перенесите их в среду первичного отбора NBD2.Через две недели, передача калли равномерно на новую тарелку, содержащую свежие среды отбора, а затем переместить калли на свежие MS среды для дифференциации и стрелять почки MS среды с 10 миллиграммов на литр Hygromycin размножаться больше побегов. Передача новых побегов в половину MS среды для корневой индукции и культуры их под светом при 25 до 28 градусов по Цельсию. Преобразованные растения должны производить корни в течение двух недель.Для выполнения наблюдения репродуктивного фенотипа удалите палею и лемму из витиеватого и изображения целых пыльей под стерео микроскопом. Чтобы наблюдать за жизнеспособностью пыльцы, выберите зрелые рисовые шипы перед цветочным антезом и удалите палею и лемму, чтобы освободить пыльники. Возьмите шесть пыль в пыль и поместите их на стеклянную горку.Добавить одну каплю дистиллированной воды, раздавить пыль с пинцетом, чтобы освободить пыльцы зерна, а затем добавить две-три капли йодного раствора и накрыть крышкой. Наблюдайте за слайдом под микроскопом с низким увеличением. Пыльца зерна окрашены черный показать более энергичную жизнеспособность в то время как зерна без цвета или те окрашенные желто-коричневый отстают или вырождаются.Для выполнения поперечной секционой микроскопии используйте 0,5%толуидин синий раствор, чтобы испачкать горки в течение 30 минут, затем промыть их водой и высушить их в дымовой капот. После высыхания, печать слайды с нейтральным клеем дерева, осторожно поместите крышку на слайде и высушить их в дым капот, а затем изображение образца под микроскопом. Этот протокол был использован для создания мужской стерильной линии Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации риса.Эмбриональные калли были непосредственно использованы для преобразования или субкультуры для распространения, чтобы получить больше калли для дальнейшей инфекции. После совместного культивирования в течение 48 часов, калли были перенесены на второй раунд отбора среды. Через 10-14 дней трансформированные калли показали недавно сформированные микрокалли, в то время как непереведенный калли посихонькался и умер.Позже, здоровые и сливочные цветные калли были переведены в регенерации среды. Преобразованный калли постепенно показал зеленые пятна. Эти зеленые пятна были выуцированы в среде регенерации для того чтобы позволить для роста съемки и после этого перенесены в половину средства MS для того чтобы навести корни.Позже были собраны здоровые и энергичные растущие побеги с хорошо развитыми корнями. Всего было получено 21 регенерированная рассада. Усиление ПЦР в регионе Гигромицин показало, что частота трансформации составила примерно 85,71%Трансформанты были генотипированными для выявления мутаций на целевых участках sgRNA.Среди 18 трансгенных растений восемь гетерозиготных линий и три гомозиготные линии были положительными CRISPR CAS9. Гомозиготные нокаут-мутанты были подтверждены основным наблюдением мужских репродуктивных органов. Пыль osabcg15 были меньше и бледнее, чем у дикого типа и не хватало зрелых зерен пыльцы.Поперечная секционая микроскопия была проведена для исследования антер морфологических дефектов в osabcg15. На стадии 10 микроспоры дикого типа стали круглой формой и вакузолировали темно-синими окрашенными экзинами. В отличие от этого, osabcg15 микроспоры рухнули и деградировали.При попытке этого протокола, важно, чтобы собранный материал находится в стадии мейоза и контролировать сухое время воздуха калли.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Лестница Rung Прогулки Задача: Система подсчета очков и ее практическое применение.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Объективы трансплантации в данио рерио и его применение в анализе глаз Мутанты

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Оптимизация и использование<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованного переходных Белок Производство в<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Трансгенные грызунов Анализ на Количественная мужской половой клетки Частота мутантного

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Мульти-отверстие криопробирку Исключает Замораживание Артефакты при мышечной ткани непосредственно погружали в жидкий азот

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium- Посредника незрелых эмбрионов Преобразование непокорных кукурузы инбредных линий с использованием морфогенных генов

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Обнаружение продукции активных форм кислорода в иммунном ответе риса в режиме реального времени с помощью хемилюминесцентного анализа

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...