Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Los autores desean reconocer a Xiaofei Chen por proporcionar las inflorescencias de arroz joven y la asistencia en la elaboración del medio de cultivo del tejido de arroz. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900611).

1. construcción de vectores de expresión vegetal sgRNA-CAS9 y transformación mediada por Agrobacterium
<ol><li>Dirigirse a un gen estéril macho OsABCG15 en arroz según la literatura publicada28.</li>
	<li>Diseñe sgRNA para el sitio de destino ubicado entre 106-125 bp en el segundo exón de OsABCG15 (Figura 1).</li>
	<li>Utilice T4 polinucleótidos quinasa para sintetizar los oligos de sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

Los mutantes estériles masculinos artificiales son generados tradicionalmente por mutagénesis física, química o biológica aleatoria. Aunque se trata de técnicas poderosas, su naturaleza aleatoria no capitaliza la gran cantidad de conocimiento genómico moderno que tiene el potencial de ofrecer mejoras personalizadas en la cría molecular32. El sistema CRISPR-Cas9 ha sido ampliamente utilizado en plantas debido a sus medios simples y asequibles para manipular y editar ADN29,...

El arroz es el cultivo alimentario más importante, particularmente en los países en desarrollo, y representa un alimento básico para más de la mitad de la población mundial. En general, la demanda de grano de arroz está creciendo y se prevé que aumente un 50% para 2030 y un 100% para 20501,2. Las futuras mejoras en el rendimiento del arroz tendrán que capitalizar diversos recursos moleculares y genéticos que hacen del arroz un modelo excelente para la investigación monocoqueledonosa de las plantas. Estos incluyen un sistema de transformación eficiente, mapa molecular avanzado y base de datos accesible al público de etiquetas de secuencia expresadas, que se han generado a lo largo de muchos años3,,4. Una estrategia para mejorar el rendimiento de los cultivos es la producción de semillas híbridas5,cuyo elemento central es la capacidad de manipular la fertilidad masculina. Comprender el control molecular de la fertilidad masculina en los cultivos de cereales puede ayudar a traducir los conocimientos clave en técnicas prácticas para mejorar la producción de semillas híbridas y mejorar la productividad de los cultivos6,,7.
La transformación genética es una herramienta clave para la investigación básica y la agricultura comercial, ya que permite la introducción de genes extraños o la manipulación de genes endógenos en las plantas de cultivo, y resulta en la generación de líneas modificadas genéticamente. Un protocolo de transformación adecuado puede ayudar a acelerar los estudios de biología genética y molecular para la comprensión fundamental de la regulación genética8. En las bacterias, la transformación genética tiene lugar de forma natural; sin embargo, en las plantas, se realiza artificialmente utilizando técnicas de biología molecular9,,10. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram-negativa transmitida por el suelo que causa la enfermedad de la agalla de la corona en las plantas mediante la transferencia de ADN-T, una región de su plásmido Ti, a la célula vegetal a través de un sistema de secreción tipo IV11,12. En las plantas, la transformación mediada por A. tumefaciensse considera un método generalizado para la modificación del gen, ya que conduce a la integración estable y bajo del número de copia del ADN-T en el genoma del huésped13. El arroz transgénico se generó por primera vez a través de la transformación genética mediada por Agrobacteriuma mediados de la década de 1990 en el cultivarjaponica 14. Usando este protocolo, se obtuvieron varias líneas transgénicas en un período de 4 meses con una eficiencia de transformación del 10%-30%. El estudio indicó que hay dos pasos críticos para la transformación exitosa: uno es la inducción del callo embrionario a partir de semillas maduras y otro es la adición de acetosyringona, un compuesto fenólico, al cultivo bacteriano durante el cultivo, que permite una mayor eficiencia de transformación en plantas14,,15. Este protocolo ha sido ampliamente utilizado con alteraciones menores en japonica16,17,18,19 así como otros cultivares como indica20,,21,22,23 y tropical japonica24,25. De hecho, más del 80% de los artículos que describen la transformación del arroz utilizan la transformación genética mediada por Agrobacteriumcomo herramienta13. Hasta la fecha, se han desarrollado varios protocolos de transformación genética utilizando semillas de arroz como material de partida para la inducción de callos16,17,18,19. Sin embargo, se sabe muy poco sobre la inflorescencia joven como explantas para la producción de callos. En general, es importante establecer un protocolo rápido, reproducible y eficiente de transformación y regeneración genética para la genómica funcional y estudios sobre la mejora de los cultivos.
En los últimos años, el avance de la tecnología CRISPR-Cas9 ha dado lugar a un mecanismo preciso de edición del genoma para comprender la función génica y ofrecer mejoras agronómicamente importantes para la cría de plantas26,,27. CRISPR también ofrece una considerable promesa para la manipulación del desarrollo reproductivo masculino y la producción híbrida. En este estudio, utilizamos un sistema de eliminación de genes utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 y lo acoplamos a un protocolo eficiente de transformación del gen del arroz utilizando inflorescencias jóvenes como explantas, creando así líneas estériles masculinas estables para el estudio del desarrollo reproductivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

La esterilidad masculina es un rasgo agronómico importante para la producción de semillas híbridas que generalmente se caracteriza por defectos funcionales en órganos reproductores/gametos masculinos. Los avances recientes en la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 permiten una alta eficacia de edición y mutaciones eliminatorias de los genes candidatos endógenos en sitios específicos. Además, la transformación genética mediada por Agrobacteriumdel arroz es también un método clave para la modificación de genes, que ha sido ampliamente adoptado por muchos laboratorios públicos y privados. En este estudio, aplicamos las herramientas de edición del genoma CRISPR-Cas9 y generamos con éxito tres líneas mutantes estériles masculinas mediante la edición específica del genoma de OsABCG15 en un cultivar de japonica. Utilizamos un método modificado de transformación de arroz mediado por Agrobacteriumque podría proporcionar excelentes medios de emasculación genética para la producción de semillas híbridas en el arroz. Las plantas transgénicas se pueden obtener en un plazo de 2 a 3 meses y los transformantes homocigotos se examinaron mediante el genotipado mediante amplificación de PCR y secuenciación de Sanger. La caracterización fenotípica básica de la línea homocigota estéril masculina se realizó mediante observación microscópica de los órganos reproductores masculinos de arroz, análisis de viabilidad del polen por yoduro de potasio yodo (I2-KI)tinción semi-delgada sección transversal de los anteras en desarrollo.

Aquí se demuestra el uso de la tecnología de edición de genes para crear una línea estéril masculina para futuras investigaciones por Agrobacterium-transformación genética mediada en el arroz. Para crear la línea estéril masculina de osabcg15,se utilizó mutagénesis mediada por CRISPR-CAS9 para la construcción de vectores binarios. El sgRNA fue impulsado por el promotor OsU3, mientras que el casete de expresión de hSpCas9 fue impulsado por el promotor 35S doble, y el vector medio fue ensambl...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Este trabajo describe el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para eliminar el gen endógeno OsABCG15 seguido de un protocolo de transformación mediado por Agrobacteriummodificado para producir una línea estable de color masculino-estéril en el arroz.

Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Las inflorescencias jóvenes como explant para la producción de callos son importantes para establecer una transformación genética rápida y eficiente y un método de regeneración para revelar la función génica, así como para la mejora de los cultivos. Las inflorescencias jóvenes como explan para la producción de callos son importantes para establecer una transformación genética rápida y eficiente y el método de regeneración para revelar la función génica. La demostración en vídeo de esta técnica ayudará al espectador a entender el proceso de mantenimiento de los materiales para producir esa alineación transgénica deseada sin perder tiempo y esfuerzo.Comience por recoger inflorescencias de arroz jóvenes del campo de arroz o de un invernadero en la etapa de meiosis, asegurándose de que estén cubiertas con la vaina de la hoja. Limpie cada inflorescencia con un hisopo de alcohol al 70% y déjelo secar antes de cortar. Lleve la inflorescencia a un banco de laboratorio estéril y córtelo en trozos pequeños con tijeras esterilizadas, luego transfiera los esquejes a una placa Petri que contenga el medio NBD2.Incubar la placa en la oscuridad a 26 grados celsius durante 10 a 14 días para inducir callo. Para realizar la transformación, transfiera una sola colonia de la placa blanca EB con antibióticos selectivos a cinco mililitros de medio YEB líquido que contenga los mismos antibióticos en un tubo de ensayo estéril cónico de 50 mililitros. Agitar el tubo en un agitador orbital a 250 veces g y 25 a 28 grados Celsius hasta que las bacterias crezcan a un OD 600 de 0.5.Añadir un mililitro de suspensión bacteriana a 100 mililitros de medio YEB con los mismos antibióticos selectivos en un matraz cónico de 250 mililitros y agitar el matraz en un agitador orbital a 250 g y 28 grados Celsius durante cuatro horas. Centrifugar el cultivo a 4.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para recoger las bacterias. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet con medio AAM AS, luego diluya la suspensión a un OD 600 de 0.4.Después de la incubación, recoger alrededor de 150 calli embriogénicos amarillo claro sano en un matraz estéril de 150 mililitros. Añadir de 50 a 75 mililitros de la suspensión celular bacteriana en el matraz y luego añadir de 10 a 25 mililitros de AAM fresco como medio para sumergir la calla durante 10 a 20 minutos, temblando ocasionalmente. Vierta la suspensión bacteriana del matraz cuidadosamente y seque la cali con papel de filtro estéril, luego colóquela en un plato de Petri con un medio NBD AS y cúbralas con papel de filtro.Incubar los callos a 25 a 28 grados centígrados en la oscuridad durante tres días, controlándolos para detectar el crecimiento excesivo bacteriano. Después de tres días de cultivo, transfiera la calita a un plato estéril de Petri con papel de filtro y, a continuación, séquelos al aire durante dos horas en un banco limpio. Asegúrese de que las callas no estén adheridas al papel filtrante y transfiéralas al medio de selección primario NBD2.Después de dos semanas, transfiera el calli uniformemente a un nuevo plato que contenga un nuevo medio de selección, luego mueva el calli al medio de LA MS fresco para la diferenciación y los cogollos de brote al medio MS con 10 miligramos por litro de higromicina para proliferar más brotes. Transfiera los nuevos brotes a medio de media NIEBLA para la inducción de la raíz y los cultivo bajo la luz a 25 a 28 grados centígrados. Las plantas transformadas deben producir raíces dentro de dos semanas.Para realizar la observación del fenotipo reproductivo, retire la palea y el lema del floro y imagine las anteras enteras bajo un microscopio estéreo. Para observar la viabilidad del polen, escoja espiguillas de arroz maduros antes de la antítesis de la flor y retire la palea y el lema para liberar las anteras. Tome seis anras y colóquelas en un tobogán de vidrio.Añadir una gota de agua destilada, aplastar la antera con pinzas para liberar los granos de polen, a continuación, añadir dos a tres gotas de solución de yodo y cubrir con un cubreobjetos. Observe la diapositiva bajo un microscopio de bajo aumento. Los granos de polen teñidos de negro muestran una viabilidad más vigorosa, mientras que los granos sin color o los de color marrón amarillo teñido se atrofian o degeneran.Para realizar la microscopía de sección transversal, utilice una solución azul de 0,5% de toluidina para manchar los portaobjetos durante 30 minutos, luego enjuáguelos con agua y séquelos en la campana del humo. Una vez secas, sella las diapositivas con pegamento de árbol neutro, coloca suavemente un cubreobjetos en el portaobjetos y sécalos en la campana de humo, luego haz una imagen de la muestra bajo un microscopio. Este protocolo fue utilizado para crear una línea estéril masculina por agrobacterium-transformación genética mediada en arroz.Los calli embrionarios se utilizaron directamente para la transformación o subcultivo para la proliferación para obtener más calli para una mayor infección. Después de co-cultivar durante 48 horas, los calli fueron trasladados a una segunda ronda de medio de selección. Después de 10 a 14 días, los calli transformados mostraron microcalli recién formados mientras que los callos no transformados se volvieron marrones y murieron.Más tarde, las calis de color sanas y cremosas se transfirieron al medio de regeneración. Los calli transformados poco a poco mostraron puntos verdes. Estas manchas verdes se cultivaron en medio de regeneración para permitir el crecimiento del brote y luego se desplazaron a medio de la mitad de la NIEBLA para inducir raíces.Más tarde, se cosecharon brotes de cultivo sanos y vigorosos con raíces bien desarrolladas. En total, se obtuvieron 21 plántulas regeneradas. La amplificación de PCR para la región de Higromicina mostró que la frecuencia de transformación era de aproximadamente 85,71%Los transformantes fueron genotipados para identificar las mutaciones en los sitios de destino de sgRNA.Entre las 18 plantas transgénicas, ocho líneas heterocigotas y tres líneas homocigotas estaban crispr CAS9 positivas. Los mutantes nocautut homocigotos fueron validados por la observación básica de órganos reproductores masculinos. Las anras de osabcg15 eran más pequeñas y más pálidas que las del tipo salvaje y carecían de granos de polen maduros.Se realizó una microscopía de sección transversal para investigar los defectos morfológicos anther en osabcg15. En la etapa 10, las microoras de tipo salvaje se volvieron redondas y vacuoladas con exine teñido de azul oscuro. Por el contrario, las microorasporas osabcg15 colapsaron y se degradaron.Al intentar este protocolo, es importante asegurarse de que el material recogido está en fase de meiosis y controlar el tiempo de secado al aire de la calla.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Investigación

Biología

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

El peldaño de la escalera a pie de la tarea: un sistema de puntuación y su aplicación práctica.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Trasplante de lentes en el pez cebra y su aplicación en el análisis de mutantes de ojos

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgénicos Roedor Ensayo para la cuantificación de la célula germinal masculina Mutant Frecuencia

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

A Multi-agujero criovial Elimina congelación Artifacts cuando los tejidos musculares se sumergen directamente en nitrógeno líquido

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Detección en tiempo real de la producción reactiva de especies de oxígeno en la respuesta inmune en el arroz con un ensayo de quimioluminiscencia

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...