Name: agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Författarna vill erkänna Xiaofei Chen för att ge unga ris blomställningar och hjälp med att göra risvävnad kultur medium. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31900611).

1. sgRNA-CAS9 växtuttryck vektor konstruktion och Agrobacterium-medierad omvandling
<ol><li>Rikta en manlig steril gen OsABCG15 i ris enligt den publicerade litteraturen28.</li>
	<li>Design sgRNA för den riktade platsen som ligger mellan 106–125 bp i den andra exon av OsABCG15 (Bild 1).</li>
	<li>Använd T4 polynukleotidkinas för att syntetisera sgRNA-oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' och 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCT...

<ol>
	<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Becoming+a+model+plant:+The+importance+of+rice+to+plant+science.">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li><li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants.">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li><li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+breeding+in+wheat:+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives.">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li><li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosis:+revisiting+the+magic.">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li><li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+food+security:+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding.">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li><li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes.">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).</li><li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae.">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).</li><li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants:+biology+and+biotechnology.">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+in+the+genomics+age.">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li><li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed.">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).</li><li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+rice+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA.">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li><li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li><li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).</li><li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+japonica+rice+(Oryza+sativa)+cultivar,+Taichung+65,+by+the+Agrobacterium-mediated+method.">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li><li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+(Oryza+sativa+L.)+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens.">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li><li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice.">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li><li>Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars.">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li><li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties.">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li><li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice.">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li><li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars.">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).</li><li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li><li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice.">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li><li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR/Cas9.">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).</li><li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein,+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice.">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants.">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li><li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+plant+development:+from+zygote+to+spikelet.">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li><li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea.">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li><li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis:+resources+and+beyond.">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39 (2013).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR/Cas+system.">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).</li></ol>

Konstgjorda manliga sterila mutanter är traditionellt genereras av slumpmässiga fysiska, kemiska, eller biologiska mutagenes. Även om dessa är kraftfulla tekniker, misslyckas deras slumpmässiga natur att dra nytta av den stora mängden modern genomisk kunskap som har potential att leverera skräddarsydda förbättringar i molekylär avel32. CRISPR-Cas9-systemet har använts i stor utsträckning i växter på grund av dess enkla och prisvärda medel för att manipulera och redigera DNA<sup cla...

Ris är den viktigaste livsmedelsgrödor, särskilt i utvecklingsländerna, och utgör en basföda för över hälften av världens befolkning. Totalt sett växer efterfrågan på rissäd och beräknas öka med 50 % fram till 2030 och 100 % fram till 20501,2. Framtida förbättringar i ris avkastning kommer att behöva kapitalisera på olika molekylära och genetiska resurser som gör ris en utmärkt modell för monocotyledonous växtforskning. Dessa inkluderar ett effektivt omvandlingssystem, avancerad molekylär karta, och allmänt tillgänglig databas med uttryckta sekvens taggar, som har genererats under många år3,4. En strategi för att förbättra skörden är hybrid utsädeproduktion 5, en central del av som är förmågan att manipulera manlig fertilitet. Att förstå den molekylära kontrollen av manlig fertilitet i spannmålsgrödor kan bidra till att översätta viktig kunskap till praktiska tekniker för att förbättra hybridutdröproduktionen och ökagrödornasproduktivitet 6,7.
Genetisk omvandling är ett viktigt verktyg för grundforskning och kommersiellt jordbruk eftersom det möjliggör införande av främmande gener eller manipulering av endogena gener i grödor, och resulterar i generering av genetiskt modifierade linjer. Ett lämpligt omvandlingsprotokoll kan bidra till att påskynda genetiska och molekylärbiologiska studier för grundläggande förståelse av genreglering8. I bakterier sker genetisk transformation naturligt; emellertid, i växter, det utförs artificiellt med hjälp av molekylärbiologiska tekniker9,10. Agrobacterium tumefaciens är en jordburen, Gramnegativ bakterie som orsakar krongall sjukdom i växter genom att överföra T-DNA, en region av dess Ti plasmid, in i växtcellen via en typ IV utsöndring system11,12. I växter, A. tumefaciens-medierad omvandling anses vara en utbredd metod för genmodifiering eftersom det leder till stabil och låg kopia nummer integration av T-DNA i värdgenomet13. Transgena ris först genereras genom Agrobacterium-medierad gen omvandling i mitten av 1990-talet i japonica kultivar14. Med hjälp av detta protokoll erhölls flera transgena linjer inom en period på 4 månader med en omvandlingseffektivitet på 10%–30%. Studien visade att det finns två kritiska steg för den framgångsrika omvandlingen: en är induktion av embryogena callus från mogna frön och en annan är tillsats av acetosyringone, en fenolförening, till bakteriekulturen under samodling, vilket möjliggör högre omvandlingseffektivitet i växter14,15. Detta protokoll har i stor utsträckning använts med mindre ändringar i japonica16,17,18,19 samt andra sorter som indica20,21,22,23 och tropiska japonica24,25. Faktum är att över 80% av de artiklar som beskriver ris omvandling använda Agrobacterium-medierad gen omvandling som ett verktyg13. Hittills har flera genetiska transformationsprotokoll tagits fram med hjälp av risutsäde som startmaterial för kallsinnigainduktion 16,17,18,19. Dock är mycket lite känt om unga blomställning som explants för kallkutproduktion. Sammantaget är det viktigt att upprätta en snabb, reproducerbar, och effektiv gen omvandling och regenerering protokoll för funktionell genomik och studier på gröda förbättring.
Under de senaste åren har utvecklingen av CRISPR-Cas9-tekniken resulterat i en exakt genomredigeringsmekanism för att förstå genfunktionen och leverera agronomiskt viktiga förbättringar för växtförädling26,27. CRISPR ger också ett stort löfte om manipulering av manlig reproduktionsutveckling och hybridproduktion. I denna studie använde vi ett gen knockout-system med CRISPR-Cas9-teknik och kopplade det till ett effektivt testprotokoll för omvandling av risgener med hjälp av unga blomställningar som explants, vilket skapar stabila sterila manliga linjer för studier av reproduktionsutveckling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#65292;4-Dichlorophenoxyacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10002918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein acid hydrolysate</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(&#8545;) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10007216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(&#8545;) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10008218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63011037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOS Digital SLR and Compact System Cameras</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS 700D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica RM 2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10000208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62011516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>H370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>63007738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(&#8545;) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>62004736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>G229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10013418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10017160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>1001721933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>R501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica M205 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit embedding Kits 7100</td>
			<td>Heraeus Teknovi, Germany</td>
			<td>14653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A515245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10024018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

Manlig sterilitet är en viktig agronomisk drag för hybrid utsäde produktion som vanligtvis kännetecknas av funktionella defekter i manliga reproduktionsorgan / könströ. De senaste framstegen inom CRISPR-Cas9-genomredigeringsteknik möjliggör hög redigeringseffekt och tidsavvisande knockout-mutationer av endogena kandidatgener på specifika platser. Dessutom är Agrobacterium-medieradgenetisk omvandling av ris också en viktig metod för genmodifiering, som har antagits i stor utsträckning av många offentliga och privata laboratorier. I denna studie, vi tillämpas CRISPR-Cas9 genomet redigeringsverktyg och framgångsrikt genererat tre manliga sterila mutant linjer genom riktade genomet redigering av OsABCG15 i en japonica sorter. Vi använde en modifierad Agrobacterium-medierad risomvandlingsmetod som kunde ge utmärkta medel för genetisk emasculation för hybridutsädeproduktion i ris. Transgena växter kan erhållas inom 2– 3 månader och homozygous transformants screenades genom genotypning med hjälp av PCR-förstärkning och Sangersekvensering. Grundläggande fenotypic karakterisering av manliga sterila homozygous linje utfördes genom mikroskopisk observation av de ris manliga reproduktiva organ, pollen viabilitet analys av jod kalium jod jod jod (jag2-KI) färgning halvtunna tvärsnitt av utveckla anthers.

Demonstreras här är användningen av genredigeringsteknik för att skapa en manlig steril linje för framtida forskning av Agrobacterium-medierad genetisk omvandling i ris. För att skapa den manliga sterila raden av osabcg15, crispr-CAS9-medierad mutagenes användes för binära vektor konstruktion. SgRNA drevs av OsU3 promotorn, medan uttrycket kassett av hSpCas9 drevs av den dubbla 35S promotorn, och den mellersta vektorn var sammansatt i en enda binär vektor pCAMBIA1300 avsedd för A...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Detta arbete beskriver användningen av CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknik för att knockout endogena genen OsABCG15 följt av en modifierad Agrobacterium-medierad omvandling protokoll för att producera en stabil han-steril linje i ris.

Agrobacterium-medierad genetisk omvandling, Transgen produktion, och dess tillämpning för studiet av manlig reproduktiv utveckling i Ris

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Unga blomställningar som explant för kallutgörsproduktion är viktiga för att etablera en snabb och effektiv genomvandling och en regenereringsmetod för att avslöja genfunktion samt för skördeförbättring. Unga blomställningar som explant för kallutgörsproduktion är viktiga för att etablera en snabb och effektiv genomvandling och regenereringsmetoden för att avslöja genfunktionen. Video demonstration av denna teknik kommer att hjälpa betraktaren att förstå processen att upprätthålla material för att producera som önskad transgena anpassa utan att slösa tid och ansträngning.Börja med att samla unga ris blomställningar från paddyfältet eller ett växthus på meiosstadiet, se till att de är täckta med bladskinn. Torka av varje blomställning med en 70%-spritsudd och låt den torka innan du skär. Ta med blomställningen till en steril labbbänk och skär den i små bitar med steriliserad sax, överför sedan sticklingarna till en Petri-platta som innehåller NBD2-medium.Inkubera plattan i mörker vid 26 grader Celsius i 10 till 14 dagar för att inducera callus. För att utföra omvandling, överföra en enda koloni från den vita EB-plattan med selektiv antibiotika till fem milliliter flytande YEB medium som innehåller samma antibiotika i en 50 milliliter koniska sterila provrör. Skaka röret på en orbital shaker på 250 gånger g och 25 till 28 grader Celsius tills bakterier växer till en OD 600 av 0,5.Tillsätt en milliliter bakteriell suspension till 100 milliliter YEB-medium med samma selektiva antibiotika i en konisk kolv på 250 milliliter och skaka kolven på en orbitalskakare vid 250 gånger g och 28 grader Celsius i fyra timmar. Centrifugera kulturen vid 4, 000 g i 10 minuter vid rumstemperatur för att samla in bakterierna. Kassera supernatanten och resuspend pelleten med AAM AS-medium, späd sedan suspensionen till en OD 600 av 0,4.Efter inkubationen, samla in cirka 150 friska ljusgula embryogropi i en 150 milliliter sterilkolv. Tillsätt 50 till 75 milliliter av bakteriecell suspensionen i kolven och tillsätt sedan 10 till 25 milliliter färskt AAM AS medium för att sänka kalli i 10 till 20 minuter, skaka ibland. Häll ut bakteriefjädringen ur kolven försiktigt och torka kalli med sterilt filterpapper, lägg dem sedan på en petriskål med NBD AS-medium och täck dem med filterpapper.Inkubera calli på 25 till 28 grader Celsius i mörkret i tre dagar, kontrollera dem för bakteriell överväxt. Efter tre dagars samodling, överför calli till en steril petriskål med hjälp av filterpapper, sedan lufttorka dem i två timmar på en ren bänk. Se till att calli inte följs till filtrerpapperet och överför dem till det primära urvalsmediet NBD2.Efter två veckor, överföra calli jämnt till en ny platta som innehåller färskt urval medium, sedan flytta calli till färska MS medium för differentiering och skjuta knoppar till MS medium med 10 milligram per liter Hygromycin att föröka fler skott. Överför de nya skotten i hälften MS-medium för rotinduktion och odla dem under ljus vid 25 till 28 grader Celsius. De transformerade växterna bör producera rötter inom två veckor.För att utföra reproduktiv fenotyp observation, ta bort palea och lemma från florid och bild hela anthers under ett stereomikroskop. För att observera pollen livskraft, plocka mogna ris spikelets före blomman anthesis och ta bort palea och lemma att släppa anthers. Ta sex anthers och placera dem på ett glas slide.Tillsätt en droppe destillerat vatten, krossa anther med pincett för att frigöra pollenkorn, tillsätt sedan två till tre droppar jodlösning och täck med ett täckskydd. Observera objektglaset under ett låg förstoringsmikroskop. Pollen korn färgade svart visar mer kraftfull livskraft medan korn utan färg eller de färgade gul brun är hämmad eller urarta.För att utföra tvärgående snittning mikroskopi, använd 0,5%toluidin blå lösning för att färga bilderna i 30 minuter, skölj dem sedan med vatten och torka dem i rök huven. När du är torr, försegla diabilderna med neutralt trädlim, placera försiktigt en täckbild på rutschkanan och torka dem i rökhuven och avbilda sedan provet under ett mikroskop. Detta protokoll användes för att skapa en manlig steril linje av Agrobacterium-medierad genetisk omvandling i ris.Den embryogenic calli användes direkt för omvandlingen eller subkultured för spridning för att erhålla mer calli för ytterligare infektion. Efter att ha samodlade i 48 timmar, flyttades calli till en andra omgång av urvalsmedium. Efter 10 till 14 dagar, omvandlas calli visade nybildade microcalli medan otransformad calli blev brun och dog.Senare överfördes friska och krämig färgade calli till regenerering medium. Den transformerade calli visade gradvis gröna fläckar. Dessa gröna fläckar odlades i förnyelse medium för att möjliggöra skjuta tillväxt och sedan flyttas till hälften MS medium för att inducera rötter.Senare skördades friska och kraftiga växande skott med välutvecklade rötter. Totalt erhölls 21 regenererade plantor. PCR-amplifiering för Hygromycin-regionen visade att omvandlingsfrekvensen var cirka 85,71%Transformanterna genotypades för att identifiera mutationerna vid sgRNA-målplatserna.Bland de 18 transgena växterna var åtta heterozygous linjer och tre homozygous linjer CRISPR CAS9 positiva. De homozygous knockout mutanter validerades av grundläggande manliga reproduktiva organ observation. Anthers av osabcg15 var mindre och blekare än de av vildtyp och saknade mogna pollenkorn.Tvärgående snittning mikroskopi utfördes för att undersöka de anther morfologiska defekter i osabcg15. I steg 10 blev mikrosporer av vildtyp rundformad och vakuolerad med mörkblå färgat exine. Däremot kollapsade osabcg15 mikrosporerna och försämrades.Vid försök till detta protokoll är det viktigt att säkerställa att det insamlade materialet är i meiosstadiet och att kontrollera den lufttorra tiden för kalli.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Trappan Rung Walking Uppgift: ett poängsystem och dess praktiska tillämpning.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Lens Transplantation i Zebrafish och dess tillämpning i analysen av Eye Mutanter

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck test på Bomull

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering och Utnyttjande av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad Transient Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgena Gnagare analys för att kvantifiera Man Germ Cell Mutant Frekvens

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

En Multi-hål cryovial Eliminerar Frysning Artefakter när Muscle Vävnader Direkt Nedsänkt i flytande kväve

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Medierad omogen embryoomvandling av motsträviga majs inavlade linjer med morfogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Realtidsdetektering av reaktiv syreradikalproduktion i immunsvar i ris med en kemiluminescensanalys

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...