Name: bovine ovarian cortex tissue culture
Uploaded: 2021-01-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture at JoVE.com

Denna forskning stöddes av National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 till ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants till ASC. United States Department of Agriculture Hatch beviljar NEB26-202/W3112 Accession #1011127 to ASC, Hatch–NEB ANHL Accession #1002234 to ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoktoral Scholar Support – COVID-19 Award för sommarfinansiering för CMS.
Författarna vill utöka sin uppskattning till Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE för att tacka honom för att ha tillhandahållit äggstockarna i en tidigare publikation, som sedan användes i det aktuella papperet som ett konceptbevis för att validera denna teknik.

Äggstockarna erhölls från U. S. Meat Animal Research Center16. Som tidigare nämnts16godkändes alla förfaranden av U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee i enlighet med guiden för vård och användning av jordbruksdjur inom jordbruksforskning och undervisning. Äggstockarna fördes till University of Nebraska-Lincoln Reproductive Laboratory där de bearbetades och odlades.
1. Förberedelse av erforderliga medi...

Fördelen med in vitro äggstockscancer cortex kultur, som beskrivs i detta manuskript, är att folliklar utvecklas i en normaliserad miljö med intilliggande stroma som omger folliklarna. De somatiska cellerna och äggcellerna förblir intakta, och det finns lämplig cell-till-cell kommunikation som en in vivo-modell. Vårt laboratorium har funnit att ett 7-dagars kultursystem ger representativ folliculogenesis och steroidogenes data för behandling av äggstockscancer cortex. Andra äggstocksvävnadskulturprotokoll har...

Äggstocksbarken representerar äggstockens yttre skikt där follikelutveckling sker1. Primordial folliklar, ursprungligen arresterade i utveckling, kommer att aktiveras för att bli primära, sekundära och sedan antral eller tertiära folliklar baserade på parakrina och gonadotropin ingångar1,2,3,4. För att bättre förstå fysiologiska processer inom äggstocken kan vävnadskulturen användas som in vitro-modell, vilket möjliggör en kontrollerad miljö för att utföra experiment. Många studier har använt äggstocksvävnadskultur för forskning inom assisterad reproduktiv teknik, fertilitetsbevarande och äggstockscancer5,6,7. Äggstocksvävnadskultur har också fungerat som en modell för att undersöka reproduktiva toxiner som skadar äggstockshälsan och etiologin av reproduktiva störningar som polycystiskt äggstockssyndrom (PCOS)8,9,10,11. Således är detta kultursystem tillämpligt på ett brett utbud av specialiteter.
Hos gnagare har hela fetala eller perinatala gonads använts i reproduktionsbiologi experiment12,13,14,15. Gonads från större husdjur kan dock inte odlas som hela organ på grund av deras stora storlek och potentiella degenerering. Därför skärs nötkreatur och icke-mänskliga primater äggstocksbarken i mindre bitar16,17,18. Många studier har odlat små äggstocksbarkbitar för att studera olika tillväxtfaktorer i ursäcksinitiering i tamdjur och icke-mänskliga primater1,17,18,19. Användningen av äggstocksbarkkulturen har också visat primordial follikelinitiering i avsaknad av serum för nötkreatur och primater när som odlas i 7 dagar20. Yang och Fortune i 2006 behandlade fetala äggstockscancer cortex kulturmedium med en rad testosteron doser under 10 dagar och observerade att10-7 M koncentrationen av testosteron ökade follikel rekrytering, överlevnad, och ökad progression av tidiga stadium folliklar19. År 2007, med hjälp av äggstocksbarkkulturer från nötkreatursfoster (5-8 månaders graviditet), rapporterade Yang och Fortune en roll för Vaskulär endoteltillväxtfaktor A (VEGFA) i den primära till sekundära follikelövergången21. Dessutom har vårt laboratorium använt äggstocksbarkkulturer för att visa hur VEGFA-isoformer (angiogena, antiangiogena och en kombination) kan reglera olika signaltransduktionsvägar genom Kinasdomänreceptorn (KDR), som är den viktigaste signaltransduktionsreceptorn som VEGFA binder16. Denna information möjliggjorde en bättre förståelse för hur olika VEGFA-isoformer påverkar signalvägar för att framkalla follikelprogression eller gripande. Sammantaget, odling av äggstockscancer cortex bitar in vitro med olika steroider eller tillväxtfaktorer kan vara en värdefull analys för att bestämma effekter på mekanismer som reglerar folliculogenesis. På samma sätt kan djur som utvecklas på olika näringssystem ha förändrat äggstocksmikromiljön, vilket kan främja eller hämma folliculogenesis som påverkar kvinnlig reproduktiv mognad. Således är vårt mål i det nuvarande manuskriptet att rapportera bovin cortex kulturteknik och avgöra om det finns skillnader i äggstockscancermiljön efter in vitro-odling av bovin cortex från kvigor som matas antingen Kontroll eller Trappsteg dieter som samlats in vid 13 månaders ålder som beskrivits tidigare16.
Därför var vårt nästa steg att bestämma äggstockscancermiljön i dessa kvigor som utvecklades med olika näringsdieter. Vi utvärderade äggstockscancer cortex från kvigor matas med antingen en Trappa-Steg eller Kontroll diet. Kontrollkvigor erbjöds en underhållsdiet på 97,9 g/kg0,75 i 84 dagar. Stair-Step dieten inleddes vid 8 månader som innehåller en begränsad matad diet på 67,4 g/kg0,75 i 84 dagar. Efter de första 84 dagarna, medan kontrollkvigor fortsatte att få 97,9 g/kg0,75,erbjöds Stair-Step nötköttskvigor 118,9 g/kg0,75 i ytterligare 68 dagar, varefter de ovariektomiserades vid 13 månaders ålder16 för att studera förändringar i follikulära stadier och morfologi före och efter kultur. Vi analyseras också för skillnader i steroider, steroid metaboliter, kemoker, och cytokiner utsöndras i cortex media. Steroider och andra metaboliter mättes för att avgöra om det fanns några direkta effekter från behandlingar som utförts in vivo och/eller in vitro på vävnadens livskraft och produktivitet. Förändringar i äggstockscancer mikromiljön före och efter kultur gav en ögonblicksbild av den endokrina miljön och folliculogenesis före kultur och hur kultur eller behandling under kultur påverkar follikel progression eller gripande.
Äggstockar samlades in efter att ovariektomier utfördes vid U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) enligt deras IACUC-procedurer från Control and Stair-Step-kvigor vid 13 månaders ålder16,rengjorda med steril fosfatbuffertsaltlösning (PBS) tvättar med 0,1% antibiotikum för att avlägsna blod och andra föroreningar, trimmad överskottsvävnad och transporteras till University of Nebraska-Lincoln (UNL) ReproductivePhysiology Laboratory . Vid UNL skars äggstocksbarkbitar i små fyrkantiga bitar (~ 0,5-1 mm3; Bild 1) och odlas i 7 dagar (figur 2). Histologi utfördes på cortexkulturens diabilder före och efter kultur för att bestämma folliklarna steg16,24 (figur 3 och figur 4), och extracellulära matrisproteiner som kan indikera fibros (Picro-Sirus Red, PSR; Bild 5). Detta möjliggjorde bestämning av effekten av in vivo näringsmässiga regimer på follikelstadier och tillät jämförelse av 7 dagar av äggstocksbarken på follikelstadier och follikelprogression. Genom hela kulturen samlades mediet in och ändrades dagligen (cirka 70% av media samlades in varje dag; 250 μL/brunn) så att antingen dagliga hormoner/cytokiner/kemoker kan bedömas eller poolas under dagar för att erhålla genomsnittliga koncentrationer. Steroider såsom androstenedione (A4) och östrogen (E2) kan poolas över 3 dagar och bedömas genom radioimmunoassay (RIA; Bild 6) och poolade under 4 dagar per djur och analyseras via högpresterande vätskekromatografi-masspektrometri (HPLC-MS)24,25 (tabell 1). Cytokinmatriser användes för att bedöma cytokin- och kemokinkoncentrationer i äggstocksbarkens odlingsmedel medium26 (tabell 2). Realtids polymeraskedjereaktion (RT-PCR) analysplattor genomfördes för att bestämma genuttryck för specifika signaltransduktionsvägar som visats tidigare16. Alla steroid, cytokin, follikelstadiet och histologiska markörer ger en ögonblicksbild av äggstockscancer mikromiljön och ledtrådar om förmågan hos den mikromiljön att främja "normala" eller "onormala" folliculogenesis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 Scapel Blade</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>303</td>
			<td>Scaple Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#21 Scapel Blade</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>307</td>
			<td>Scaple Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500mL Bottle Top Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430514</td>
			<td>Bottle Top Filter 0.22 &#181;m pore for filtering medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbsoluteIDQ Sterol17 Assay</td>
			<td>Biocrates</td>
			<td>Sterol17 Kit</td>
			<td>Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androstenedione Double Antibody RIA Kit</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>7109202</td>
			<td>RIA to determine androstenedione from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belgium A4 Assay Kit&#160;</td>
			<td>DIA Source&#160;</td>
			<td>KIP0451</td>
			<td>RIA to determine androstenedione from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cytokine Array Q3</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>QAB-CYT-3-1</td>
			<td>Cytokine kit to determine cytokines from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Software Standard 1.3</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>7790</td>
			<td>Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5150056</td>
			<td>Addative to the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4130039</td>
			<td>Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Disection microscope used for imaging tissue culture pieces&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP71</td>
			<td>Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts 0.4&#181;m, 12,mm Diameter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>Plate used to hold meduim, inserts, and tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>Petri dish used for washing steps prior to culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Used for tissue washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Version 9.3</td>
			<td>SAS Institute&#160;</td>
			<td>9.3 TS1M2</td>
			<td>Statistical analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6727C10</td>
			<td>Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waymouth MB 752/1 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1625</td>
			<td>Medium used for tissue cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bovine ovarian cortex tissue culture

Follikelutveckling från det ursprungliga till antralstadiet är en dynamisk process inom äggstocksbarken, som inkluderar endokrina och parakrrinfaktorer från somatiska celler och cumulus cell-oocyte kommunikation. Lite är känt om äggstocksmikromiljön och hur cytokinerna och steroider som produceras i den omgivande miljön påverkar follikelprogression eller gripande. In vitro-kulturen av äggstocksbarken gör det möjligt för folliklar att utvecklas i en normaliserad miljö som förblir stödd av intilliggande stroma. Vårt mål var att bestämma effekten av näringsmässiga Stair-Step diet på äggstockscancer mikromiljön (follikel utveckling, steroid och cytokin produktion) genom in vitro kultur av nötkreatur äggstockscancer cortex. För att uppnå detta avlägsnades äggstockscancer kortikala bitar från kvigor som genomgår två olika näringsutvecklade system före puberteten: Kontroll (traditionell näringsutveckling) och Trappsteg (utfodring och begränsning under utveckling) som skars i cirka 0,5-1 mm3 stycken. Dessa bitar passerades därefter genom en serie tvättar och placerades på en vävnadsodlingsinsats som sätts in i en brunn som innehåller Waymouths odlingsmedium. Äggstockscancer cortex odlades i 7 dagar med dagliga kultur media förändringar. Histological avsnitt utfördes för att bestämma follikel steg förändringar före och efter kulturen för att bestämma effekter av näring och inverkan av kultur utan ytterligare behandling. Cortex kultur medium poolades över dagar för att mäta steroider, steroid metaboliter, och cytokiner. Det fanns tendenser för ökade steroidhormoner i äggstockscancer som möjliggjorde follikelprogression i trappsteg kontra kontroll äggstocksbarken kulturer. Äggstocksbarkens kulturteknik möjliggör en bättre förståelse för äggstocksmikromiljön och hur förändringar i endokrin utsöndring kan påverka follikelprogression och tillväxt från både in vivo- och in vitro-behandlingar. Denna kulturmetod kan också visa sig fördelaktig för att testa potentiella terapier som kan förbättra follikelprogression hos kvinnor för att främja fertilitet.

Detta nötkreatur cortex odling förfarande kan användas för att bestämma en mängd olika hormon, cytokin och histologi data från små bitar av äggstocken. Färgning, såsom hematoxylin och eosin (H&E), kan användas för att bestämma äggstocksmorfologi genom follikel iscensättning16,23,31 ( figur3). Kort klassificerades folliklar som primordial, vilket är en äggcell omgiven av ett enda la...

Watch this Scientific Journal Video about Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture at JoVE.com

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

In vitro kultur av nötkreatur äggstockscancer cortex och effekten av näringsmässiga Stair-steg diet på äggstockscancer mikromiljön presenteras. Äggstockscancer cortex bitar odlades i sju dagar och steroider, cytokiner och follikel stadier utvärderades. Stair-Step diet behandling hade ökad steroidogenes som resulterar i follikel progression i kultur.

Vävnadskultur för bovinscancer

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Detta protokoll möjliggör en djupgående undersökning av äggstockscancermiljön. Gör det möjligt för användare att bestämma follikel tillväxt och utveckling, liksom steroidogenes och överflöd av immunmolekyler. En fördel med denna teknik är förmågan att direkt utvärdera förändringar i äggstockscancermiljön och framväxande folliklar och bedöma det unika samspelet som orsakas av tillsats av specifika hormoner.Denna teknik kan användas för att studera en mängd olika reproduktiva störningar som orsakar follikulära gripanden. Till exempel polycystiskt ovariesyndrom. Eftersom vi direkt kan utvärdera den äggstockscancer mikro miljön in vitro, visar förfarandet kommer att vara Brooke Bell, en grundutbildning forskare från mitt laboratorium.Använd cerated käktång, säkra äggstocken, skiva i hälften och börja ta bort yttre skivor. Se till att inte mer än en till två millimeters ytdjup skärs bort från äggstocken så att ingen medulla samlas in. Skär tre till fyra tunna remsor av äggstocksbarken med en skalpell och placera remsorna i den tredje PBS-fyllda Petri-skålen.Skär remsorna i små fyrkantiga bitar på 0,5 till en kubikmillimeter med ett skalpellblad. Använd en linjal under Petri-disken för att säkerställa att bitarna är av liknande storlek och tjocklek för att göra konsekventa äggstocksbarkbitar. Tvätta äggstocksdjur i alla tre PBS- och antibiotikafältet Petri-rätter, med böjda spetstänger för att flytta bitarna mellan tvättar.Flytta cortexbitar genom serien av LB-15 tvättar och placera dem i en slutlig LB-15-fylld Petri-maträtt. Märk locket med djur-ID och äggstockssidan. Samla fyra äggstocksbarkbitar per äggstock och fixa dem för dag noll histologi och frys ytterligare bitar för RNA-rening.Använd de återstående vävnadsbitarna för odling. Förbered ett biologiskt säkerhetsskåp för en slutlig vävnadstvätt och odlingsberedning. Sanera förnödenheter med 70% etanol innan du placerar dem i det biologiska säkerhetsskåpet.Flytta alla äggstocksbarkbitar avsedda för kultur till det biologiska säkerhetsskåpet och tvätta dem ännu en gång i en LB-15-fylld Petri-maträtt. Pipett 350 mikroliter waymouth medium per brunn i en 24 brunn vävnadsodlingsplatta. Placera obelagda odlingsbrunnsinsatser i varje brunn med tång och se till att inga bubblor bildas under skärets botten.Placera försiktigt och försiktigt fyra äggstocksbarkbitar på nätet på varje insats utan att punktera nätet. Inkubera vävnaden vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Byt äggstocksbarkkulturmedium dagligen i sju dagar och se till att använda förvärmt Waymouth-medium.Under mediumbytena, använd tång för att försiktigt lyfta insatsen ur brunnen och samla det odlade Waymouth-mediet i 0,5 milliliterrör. Sätt tillbaka insatsen i brunnen och tillsätt 350 mikroliter färskt odlingsmedium genom att fördela den mellan sidan av insatsen och brunnen. Förvara det insamlade mediet från vävnadskulturen vid minus 20 grader Celsius.Efter sju dagars kultur, avbilda äggstocksbarken bitar med hjälp av ett dissekeringsmikroskop med en bifogad kamera och ett datoravbildningsprogram. Fixa två äggstockscancer cortex bitar per brunn i Bouins lösning för histologi och flash frysning till äggstockscancer cortex bitar i flytande kväve för att få RNA för cDNA. Upprepa detta steg för alla brunnar med vävnad och samla sedan mediet från dag sju och lagra det minus 20 grader.Låt äggstocksbarken förbli nedsänkta i Bouins lösning i cirka 1,5 timmar, tvätta dem sedan med 70% etanol tre gånger, håll vävnaden i 70% etanol och rensa den dagligen tills lösningen inte längre är gul. Hematoxylin och eosin fläck utfördes för primordial folliklar, tidiga primära folliklar, primära follikel, sekundära follikel och antral follikel. Follikel iscensättning genomfördes på en äggstockscancer cortex fastställt före och efter kultur för att bedöma folliculogenesis.Skillnaden i morfologi som bestäms av kollagendeposition kan indikera fibros i äggstocksbarken från trappsteg eller kontrollkvigor. En jämförelse av det genomsnittliga området av picrosirius röd positiv färgning per äggstockscancer cortex fylld mellan kontroll och trappsteg kvigor visas här. Daglig samling av kultur medium poolades under tre dagar för att bedöma varierade steroid hormonproduktion, med hjälp av en radioimmunoassay.Steroid metaboliter och cytokin produktion mättes också i äggstockscancer cortex kultur medium från en brunn för varje djur pooled över fyra dagar av kultur. Ju längre vävnaden sitter, desto svårare kan det vara att arbeta med. Du kan behöva öva exakta nedskärningar.Denna teknik används för att förstå effekterna på signaltransduktion vägar för att rädda överskott steroidogenes för att bestämma effekterna av överskott steroider på cytokin och kemokin produktion, och att bestämma effekterna på follikel progression eller gripande inom äggstocksvävnaden.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning Fibrer Polymer Byggnadsställningar för tissue engineering och cellodling

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vävnadskultur modell av östrogen-producerande primära nötkreatur Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovin bröstkörteln biopsi tekniker

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Reproduktionsteknik för ovariell övervakning och kontroll i amfibier

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

En ex vivo vävnad kultur modell av brosk remodeling i nötkreatur knä Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Vävnads insamling av fladdermöss för-omics-analyser och primär cell kultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Utvärdering av de angiogenetiska egenskaperna hos äggstockscancer stamliknande celler med hjälp av det tredimensionella samodlingssystemet, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Avslöja inflammatorisk artrit: Utforska funktioner hos synovialceller

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Författare Spotlight: Isolering och odling av primära synoviala makrofager och fibroblaster från murin artritvävnad  

Isolering och odling av primära synoviala makrofager och fibroblaster från murin artritvävnad

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...