Name: demonstration of heterologous complexes formed by golgi-resident type iii membrane proteins using split luciferase complementation assay
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la subvention n° 2016/23/D/NZ3/01314 du Centre national des sciences (NCN), Cracovie, Pologne.

1. Génération de plasmides d’expression
<ol><li>Examiner la topologie membranaire des protéines d’intérêt à l’aide d’un outil de prédiction de topologie.</li>
	<li>Concevoir la stratégie de clonage de manière à ce que les fragments les plus grands et les plus petits fassent face au cytoplasme une fois que les protéines de fusion ont été insérées dans les membranes de Golgi. Si, comme dans le cas présenté ici, les N- et C-termini des protéines d’intérêt sont orientées cytoplasmiquement, ma...

<ol>
	<li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters:+Current+progress.">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li><li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution,+identification,+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter.">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li><li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter.">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li><li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum.">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li><li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line.">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li><li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane.">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li><li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation.">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li><li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer.">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).</li><li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1,4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT.">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).</li><li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous,+multi-specific,+hexameric+complex+of+LPG2+subunits.">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li><li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4.">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li><li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose:ceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum.">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li><li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+(SLC35A2)+and+UDP-N-acetylglucosamine+(SLC35A3)+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+(Mgats).">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li><li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo.">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals.">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li><li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs.">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li><li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes.">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li><li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+(TUBEs).">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li><li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization.">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li><li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+(NanoBiT).">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275 (2020).</li><li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time.">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li></ol>

Nous fournissons ici un protocole détaillé permettant la démonstration de complexes hétérologues formés entre des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi, telles que les NST, en utilisant le test de complémentation de la luciférase divisée. L’approche proposée pour l’analyse et l’interprétation des données consiste à relier la luminescence obtenue pour la combinaison de protéines d’intérêt à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin correspondante, qui est composée de ...

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour vérifier la présence d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dans des cellules humaines transfectées transitoirement en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée. La procédure a été le plus largement testée contre les transporteurs de sucre nucléotidique (NST), mais nous avons également pu obtenir des résultats positifs pour d’autres protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dont les N- et / ou C-termini font face au cytoplasme.
Notre groupe de recherche explore le rôle des NST dans la glycosylation des macromolécules. Les NST sont des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et/ou d’ER avec N- et C-termini faisant face au côté cytoplasmique de la membrane organellaire1. On pense que les NST transportent les sucres activés par les nucléotides à travers les membranes des organites pour fournir aux glycosyltransférases leurs substrats. Les NST forment des dimères et/ou des oligomères supérieurs2,3,4,5,6,7,8,9,10. De plus, des interactions hétérologues entre différents NST ont également été rapportées6,11. Il a également été démontré que les NST forment des complexes avec des enzymes de glycosylation fonctionnellement liées12,13,14. Nous avons cherché une alternative à la technique actuellement utilisée, l’approche FRET basée sur l’imagerie par fluorescence de la durée de vie (FLIM), pour étudier les interactions des NST et des protéines résidentes de Golgi fonctionnellement apparentées, nous avons donc décidé de tester le test de complémentation de la luciférase fractionnée. Il nous a permis d’identifier une nouvelle interaction entre un NST et une enzyme de glycosylation fonctionnellement liée9.
La modification la plus récente du test de complémentation de la luciférase fractionnée, NanoBiT, est utilisée dans le protocole présenté ici15. Il repose sur la reconstitution de l’enzyme luciférase (par exemple, NanoLuc) à partir des deux fragments - le grand, appelé grand BiT ou LgBiT, une protéine de 17,6 kDa, et le petit, composé de seulement 11 acides aminés, appelé petit BiT ou SmBiT. Les deux protéines d’intérêt sont fusionnées avec les fragments complémentaires et exprimées transitoirement dans une lignée cellulaire humaine. Si les deux protéines de fusion interagissent, une luminescence est produite in situ lors de l’ajout d’un substrat perméable aux cellules. Ces deux fragments ont été optimisés de manière à ce qu’ils s’associent avec une affinité minimale à moins d’être rapprochés par une interaction entre les protéines d’intérêt auxquelles ils sont fusionnés.
En général, les méthodes basées sur la bioluminescence présentent certains avantages par rapport à celles basées sur la fluorescence. Les signaux bioluminescents ont un rapport signal/bruit plus élevé car la luminescence de fond est négligeable par rapport au signal dérivé de la luciférase16. En revanche, les approches basées sur la fluorescence souffrent généralement d’un fond relativement élevé causé par le phénomène d’autofluorescence. En outre, la bioluminescence est moins préjudiciable aux cellules analysées que la fluorescence, car dans le premier cas, il n’est pas nécessaire d’exciter l’échantillon. Pour ces raisons, les approches bioluminescentes pour étudier les IPP in vivo surpassent les méthodes fluorescentes couramment utilisées comme le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) ou la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC).
Notre protocole repose sur la luminescence de référence obtenue pour la combinaison de protéines d’intérêt à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin. Ce dernier comprend l’une des protéines testées qui est fusionnée avec un fragment plus grand et une protéine de contrôle (par exemple, HaloTag), fusionnée avec un fragment plus petit. Cette dernière est une protéine d’origine bactérienne qui ne devrait interagir avec aucune des protéines de mammifères. L’utilisation de cette protéine comme témoin pose des limites à la topologie des paires de protéines résidentes de Golgi à analyser. Étant donné que dans les cellules de mammifères, cette protéine est synthétisée dans le cytoplasme, les deux protéines d’intérêt doivent avoir au moins une queue cytoplasmique.
Cette approche peut être particulièrement utile pour le dépistage initial des IPP. Elle peut devenir la méthode de choix lorsque les protéines de fusion d’intérêt sont exprimées à des niveaux tout simplement insuffisants pour que d’autres approches puissent être appliquées. De même, le test de complémentation de la luciférase fractionnée peut être la meilleure option si les protéines d’intérêt sont exprimées à des niveaux élevés, mais cela affecte négativement leur localisation subcellulaire ou est connu pour forcer des interactions non spécifiques. Étant donné que le plus petit fragment ne contient que 11 acides aminés, le test de complémentation de la luciférase fractionnée peut être appliqué lorsque l’utilisation de marqueurs plus grands est impossible. Enfin, il peut être utilisé pour confirmer davantage les données obtenues à l’aide d’autres techniques, comme dans le cas présenté ici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adherent mammalian cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium dedicated to the cell line used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT MCS Starter System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Live Cell Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2011</td>
			<td>This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oribital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of heterologous complexes formed by golgi-resident type iii membrane proteins using split luciferase complementation assay

L’objectif de ce protocole est d’explorer l’applicabilité de la variante la plus récente de la complémentation de la luciférase divisée pour démontrer les complexes hétérologues formés par les transporteurs de sucre nucléotidique (NST). Ces protéines multitransmembranaires résidentes en ER et Golgi transportent les sucres nucléotidiques synthétisés cytoplasmiquement à travers les membranes des organites pour fournir des enzymes qui médient la glycosylation avec leurs substrats. Les NST existent sous forme de dimères et/ou d’oligomères supérieurs. Des interactions hétérologues entre différents NST ont également été rapportées. Pour vérifier si la technique est adaptée à l’étude du phénomène d’hétéromérisation NST, nous l’avons testée par rapport à une combinaison des deux NST résidents de Golgi dont il a été précédemment démontré qu’ils s’associent par plusieurs autres moyens. Le test de complémentation de la luciférase semble particulièrement adapté à l’étude des interactions entre les protéines membranaires résidentes de Golgi, car il ne nécessite pas de niveaux d’expression élevés, ce qui déclenche souvent une mauvaise localisation des protéines et augmente le risque de faux positifs.

Pour obtenir les données les plus fiables dans cette approche, toutes les combinaisons possibles doivent être testées (voir figure 1). En parallèle, des contrôles positifs et négatifs devraient être inclus. Le témoin positif doit être constitué des deux protéines connues pour interagir, dont l’une est fusionnée avec le plus grand fragment et l’autre est fusionnée avec le plus petit fragment. Le témoin négatif devrait idéalement être constitué des deux protéines membran...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay at JoVE.com

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

Le protocole présenté ici vise à démontrer l’apparition d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et les N- et/ou C-termini exposées cytoplasmiquement dans des cellules de mammifères vivants en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée.

Démonstration de complexes hétérologues formés par des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi à l’aide d’un test de complémentation de la luciférase fractionnée

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Our protocol allows to identify and analyze interactions between multi transmembrane proteins of the endoplasmic reticulum and golgi complex in living cells at low expression levels. The main advantage of this technique is it's to special sensitivity, which allows to avoid high over expression levels that are often detrimental to cellular health and may disturb protein subcellular localization. Harvest the adherent HEK293 T-cell culture by trypsinization and re-suspend the cells in a dedicated complete growth medium.Plate the cells onto a clear bottom, white side 96-well plate. Adjust the total number of wells to accommodate all tested combinations and controls, including replicates. Then, culture the cells overnight in standard conditions.On the next day, transfect the cells with the desired combinations of expression plasmids. Dilute the plasmids in a serum-free medium to 6.25 nanograms per microliter for each construct and add the lipid-based transfection reagent. Add an appropriate lipid to DNA ratio.Incubate the plasmids according to manufacturer's instruction. Then, add eight microliters of the lipid DNA mixture to the designated wells. Mix the content of the plate with gentle rotation and culture the cells for 20 24 hours in standard conditions.On the next day, replace the conditioned medium in each well with 100 microliters of a serum-free medium, making sure that the cells do not detach upon medium exchange. Just before measuring luminescence, mix one volume of furimazine with 19 volumes of a dilution buffer. Add 25 microliters of the furimazine working solution into each well, and gently mix the plate by hand or with a orbital shaker.Insert the plate into a luminescence micro plate reader and equilibrate the plate at 37 degrees Celsius for 10 15 minutes. Select the wells to be analyzed and read luminescence with an integration time of 0.3 seconds. Continue to monitor luminescence for up to two hours when required.This protocol was tested on two nucleotide sugar transporters, SLC35A2 and SLC35A3, which are golgi-resident type three membrane proteins with N and C termini facing the cytoplasm. There were eight possible tagging options and the resulting fusion proteins could be set together in eight possible ways. Mean relative luminescence units or RLU values corresponding to all the tested and control combinations are shown here.The RLU values obtained for three of the combinations were significantly higher than those obtained for the corresponding control combination. To obtain ratio values for the combinations of interest, the RLU values were divided by the RLU values obtained for the respective controls. Ratios between 10 and 1000 are highly indicative of specific interactions.There were two such combinations supporting the idea that SLC35A2 and SLC35A3 interact. To confirm this data, HA tagged SLC35A2 or SLC35A3 were co-expressed with the combination that resulted in the highest relative luminescence. Varying amounts of the plasmids and coding HA tagged NST variants were used for co-transfection, resulting in a statistically significant dose dependent decrease in RLU values.The most critical thing is to tackle your protein self interest in all possible ways and to assay all possible combination, as some tagging orientation may produce false negative results. Once the best performing combination has been selected, the dynamics of the corresponding interaction can be monitored to, for example identify agents or conditions that disrupt your complex of interest over time.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Recherche

Biologie

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

Profilage anticorps par immunoprécipitation Systèmes luciférase (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l&#39;expression de bactéries de type III Effectors dans la levure

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...