Name: demonstration of heterologous complexes formed by golgi-resident type iii membrane proteins using split luciferase complementation assay
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מס ' 2016/23/D/NZ3/01314 מהמרכז הלאומי למדע (NCN), קרקוב, פולין.

1. דור הפלסמידים של הביטוי
<ol><li>בחן את טופולוגיית הממברנה של החלבונים המעניינים באמצעות כלי חיזוי טופולוגיה.</li>
	<li>תכנן את אסטרטגיית השיבוט כך שהשברים הגדולים והקטנים יותר יעמדו בפני הציטופלסמה ברגע שחלבוני ההיתוך הוכנסו לקרומי גולגי. אם, כמו במקרה המוצג כאן, הן N והן C-termini של חלבונים מעני?...

<ol>
	<li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters:+Current+progress.">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li><li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution,+identification,+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter.">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li><li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter.">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li><li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum.">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li><li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line.">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li><li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane.">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li><li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation.">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li><li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer.">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).</li><li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1,4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT.">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).</li><li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous,+multi-specific,+hexameric+complex+of+LPG2+subunits.">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li><li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4.">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li><li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose:ceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum.">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li><li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+(SLC35A2)+and+UDP-N-acetylglucosamine+(SLC35A3)+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+(Mgats).">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li><li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo.">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals.">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li><li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs.">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li><li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes.">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li><li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+(TUBEs).">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li><li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization.">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li><li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+(NanoBiT).">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275 (2020).</li><li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time.">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li></ol>

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המאפשר הדגמה של מתחמים הטרולוגיים שנוצרו בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי, כגון NSTs, באמצעות בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. הגישה המוצעת לניתוח נתונים ופרשנות כרוכה בהתייחסות לאור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב השליטה המתאים, המורכב מ?...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבדוק את נוכחותם של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי בתאים אנושיים שהודבקו באופן חולף באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. ההליך נבדק בהרחבה ביותר נגד מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs) אבל הצלחנו גם להשיג תוצאות חיוביות עבור חלבונים אחרים מסוג גולגי סוג III ממברנה אשר N- ו / או C-termini עומדים בפני הציטופלסמה.
קבוצת המחקר שלנו בוחנת את תפקידם של NSTs בגליקוזילציה של מקרומולקולות. NSTs הם חלבוני ממברנה מסוג III מסוג Golgi ו/או ER עם N- ו- C-termini הפונים לצד הציטופלסמי של הממברנה האורגנית1. NSTs נחשבים לשאת סוכרים המופעלים נוקלאוטידים על פני ממברנות אברונים כדי לספק גליקוסילטרפרנספראזס עם המצעים שלהם. NSTs יוצרים דימרים ו/או אוליגומרים גבוהים יותר2,3,4,5,6,7,8,9,10. יתר על כן, אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים דווחו גם 6,11. NSTs הוכחו גם כדי ליצור קומפלקסים עם אנזימי גליקוסילציה הקשורים פונקציונלית12,13,14. חיפשנו אלטרנטיבה לטכניקה הנמצאת בשימוש כיום, הדמיה לכל החיים פלואורסצנטית (FLIM) מבוססת גישת FRET, לחקר אינטראקציות של NSTs וחלבונים הקשורים לגולגי הקשורים לתפקוד, ולכן החלטנו לבדוק את בדיקת ההשלמה של לוציפראז הפיצול. זה איפשר לנו לזהות אינטראקציה חדשנית בין NST ואנזים גליקוזילציה הקשורים לתפקודית9.
השינוי האחרון של בדיקת ההשלמה פיצול לוציפראז, NanoBiT, משמש בפרוטוקול המוצג כאן15. הוא מסתמך על שחזור של האנזים לוציפראז (למשל, NanoLuc) משני השברים - הגדול, המכונה BiT גדול או LgBiT, חלבון 17.6 kDa, ואת הקטן, המורכב רק 11 חומצות אמינו, המכונה BiT קטן או SmBiT. שני החלבונים המעניינים מותכים עם השברים המשלימים ומתבטאים באופן חולף בקו תאים אנושי. אם שני חלבוני ההיתוך מתקשרים, אור נוצר במקום עם תוספת של מצע חדיר לתא. שני שברים אלה עברו אופטימיזציה כך שהם מתרועעים עם זיקה מינימלית אלא אם כן הם מובאים יחד על ידי אינטראקציה בין חלבוני העניין שהם מותכים.
באופן כללי, לשיטות מבוססות ביולומינציה יש כמה יתרונות על פני אלה המבוססים על פלואורסצנטיות. לאותות ביו-זוהרים יש יחס אות-לרעש גבוה יותר מכיוון שהאור ברקע זניח בהשוואה לאות שמקורו בלוציפראז16. לעומת זאת, גישות מבוססות פלואורסצנטיות סובלות בדרך כלל מרקע גבוה יחסית הנגרם על ידי תופעת ההפלורציה האוטומטית. חוץ מזה, ביולומינציה פחות מזיקה לתאים המנותחים מאשר פלואורסצנטיות, כמו במקרה הקודם אין צורך לרגש את המדגם. מסיבות אלה גישות ביו-זוהרות לחקר PPIs ב- vivo עולות על השיטות הפלואורסצנטיות הנפוצות כמו העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) או השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC).
הפרוטוקול שלנו מסתמך על הפניית אור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב הבקרה. האחרון כולל את אחד החלבונים שנבדקו אשר מותך עם שבר גדול יותר חלבון בקרה (למשל, HaloTag), התמזג עם שבר קטן יותר. האחרון הוא חלבון ממוצא חיידקי שאינו צפוי לקיים אינטראקציה עם אף אחד מחלבוני היונקים. שימוש בחלבון זה כבקרה מציב מגבלות לטופולוגיה של זוגות החלבונים של תושבי גולגי שיש לנתח. מאז בתאי יונקים חלבון זה מסונתז בציטופלסמה, שני החלבונים של עניין צריך להיות לפחות זנב ציטופלסמי אחד.
גישה זו יכולה להיות שימושית במיוחד להקרנה ראשונית של ממשקי PPIs. זה עשוי להיות שיטת הבחירה כאשר חלבוני ההיתוך של עניין באים לידי ביטוי ברמות כי הם פשוט לא מספיק עבור גישות אחרות להיות מיושם. באופן דומה, הבדיקה המשלימה לוציפראז פיצול יכול להיות האפשרות הטובה ביותר אם החלבונים של עניין באים לידי ביטוי ברמות גבוהות, אבל זה משפיע לרעה על לוקליזציה תת תאית שלהם או ידוע לכפות אינטראקציות לא ספציפיות. מאז שבר קטן יותר יש רק 11 חומצות אמינו, בדיקת ההשלמה לוציפראז לפצל ניתן ליישם בעת שימוש בתגים גדולים יותר הוא בלתי אפשרי. לבסוף, ניתן להשתמש בו כדי לאשר עוד יותר נתונים שהושגו באמצעות טכניקות אחרות, כמו במקרה המוצג כאן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adherent mammalian cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium dedicated to the cell line used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT MCS Starter System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Live Cell Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2011</td>
			<td>This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oribital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of heterologous complexes formed by golgi-resident type iii membrane proteins using split luciferase complementation assay

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את הישימות של הגרסה האחרונה של השלמת לוציפראז מפוצל להדגמת מתחמים הטרולוגיים שנוצרו על ידי מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs). חלבונים רב-תכליתיים אלה, התושבים בחדר המיון ובגולגי, נושאים את הסוכרים הנוקלאוטידים המסונתזים מבחינה ציטופלסמית על פני ממברנות האברונים כדי לספק אנזימים המתווכים גליקוזילציה עם המצעים שלהם. NSTs קיימים כמו דימרים ו / או אוליגומרים גבוהים יותר. כמו כן דווח על אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים. כדי לוודא אם הטכניקה מתאימה לחקר התופעה של הטרומריזציה של NST, בדקנו אותה מול שילוב של שני NSTs תושב גולגי שהוכחו בעבר כמקשרים במספר אמצעים אחרים. בדיקת ההשלמה של לוציפראז נראית מתאימה במיוחד לחקר אינטראקציות בין חלבוני ממברנה תושבי גולגי, שכן היא אינה דורשת רמות הבעה גבוהות, אשר לעתים קרובות לעורר מיקום שגוי של חלבון ולהגדיל את הסיכון של חיובי שווא.

כדי להשיג את הנתונים האמינים ביותר בגישה זו יש לבדוק את כל השילובים האפשריים (ראו איור 1). במקביל, יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים. השליטה החיובית צריכה להיות מורכבת משני החלבונים הידועים כאינטראקציה, מתוכם אחד מותך עם השבר הגדול יותר והשני מותך עם השבר הקטן יותר. השליטה השל...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay at JoVE.com

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Our protocol allows to identify and analyze interactions between multi transmembrane proteins of the endoplasmic reticulum and golgi complex in living cells at low expression levels. The main advantage of this technique is it's to special sensitivity, which allows to avoid high over expression levels that are often detrimental to cellular health and may disturb protein subcellular localization. Harvest the adherent HEK293 T-cell culture by trypsinization and re-suspend the cells in a dedicated complete growth medium.Plate the cells onto a clear bottom, white side 96-well plate. Adjust the total number of wells to accommodate all tested combinations and controls, including replicates. Then, culture the cells overnight in standard conditions.On the next day, transfect the cells with the desired combinations of expression plasmids. Dilute the plasmids in a serum-free medium to 6.25 nanograms per microliter for each construct and add the lipid-based transfection reagent. Add an appropriate lipid to DNA ratio.Incubate the plasmids according to manufacturer's instruction. Then, add eight microliters of the lipid DNA mixture to the designated wells. Mix the content of the plate with gentle rotation and culture the cells for 20 24 hours in standard conditions.On the next day, replace the conditioned medium in each well with 100 microliters of a serum-free medium, making sure that the cells do not detach upon medium exchange. Just before measuring luminescence, mix one volume of furimazine with 19 volumes of a dilution buffer. Add 25 microliters of the furimazine working solution into each well, and gently mix the plate by hand or with a orbital shaker.Insert the plate into a luminescence micro plate reader and equilibrate the plate at 37 degrees Celsius for 10 15 minutes. Select the wells to be analyzed and read luminescence with an integration time of 0.3 seconds. Continue to monitor luminescence for up to two hours when required.This protocol was tested on two nucleotide sugar transporters, SLC35A2 and SLC35A3, which are golgi-resident type three membrane proteins with N and C termini facing the cytoplasm. There were eight possible tagging options and the resulting fusion proteins could be set together in eight possible ways. Mean relative luminescence units or RLU values corresponding to all the tested and control combinations are shown here.The RLU values obtained for three of the combinations were significantly higher than those obtained for the corresponding control combination. To obtain ratio values for the combinations of interest, the RLU values were divided by the RLU values obtained for the respective controls. Ratios between 10 and 1000 are highly indicative of specific interactions.There were two such combinations supporting the idea that SLC35A2 and SLC35A3 interact. To confirm this data, HA tagged SLC35A2 or SLC35A3 were co-expressed with the combination that resulted in the highest relative luminescence. Varying amounts of the plasmids and coding HA tagged NST variants were used for co-transfection, resulting in a statistically significant dose dependent decrease in RLU values.The most critical thing is to tackle your protein self interest in all possible ways and to assay all possible combination, as some tagging orientation may produce false negative results. Once the best performing combination has been selected, the dynamics of the corresponding interaction can be monitored to, for example identify agents or conditions that disrupt your complex of interest over time.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

זיהוי של פנוטיפים עיכוב גדילה מושרה על ידי הבעת effectors סוג חיידקית השלישי שמרים

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...