Name: demonstration of heterologous complexes formed by golgi-resident type iii membrane proteins using split luciferase complementation assay
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00
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この研究は、ポーランドのクラクフにある国立科学センター(NCN)からの助成金番号2016/23/D/NZ3/01314によって支援されました。

発現プラスミドの作製
<ol><li>トポロジー予測ツールを使用して、目的のタンパク質の膜トポロジーを調べます。</li>
	<li>融合タンパク質がゴルジ膜に挿入されると、大きい断片と小さい断片が細胞質に面するようにクローニング戦略を設計します。ここで提示する場合のように、目的のタンパク質のN末端とC末端の両方が細胞質的に配向している場合は、8つの可能な方法でタンパク質にタグ...

<ol>
	<li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters:+Current+progress.">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li><li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution,+identification,+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter.">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li><li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter.">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li><li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum.">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li><li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line.">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li><li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane.">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li><li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation.">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li><li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer.">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).</li><li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1,4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT.">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).</li><li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous,+multi-specific,+hexameric+complex+of+LPG2+subunits.">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li><li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4.">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li><li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose:ceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum.">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li><li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+(SLC35A2)+and+UDP-N-acetylglucosamine+(SLC35A3)+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+(Mgats).">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li><li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo.">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals.">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li><li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs.">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li><li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes.">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li><li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+(TUBEs).">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li><li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization.">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li><li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+(NanoBiT).">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275 (2020).</li><li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time.">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li></ol>

ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイを使用して、NSTなどのゴルジ常駐III型膜タンパク質間に形成される異種複合体の実証を可能にする詳細なプロトコルを提供します。データ解析および解釈への提案されたアプローチは、目的のタンパク質の組み合わせについて得られた発光を、より大きな断片と融合した目的のタンパク質の1つおよびより小さい断片と融合した細菌起源の制御タン...

この原稿では、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新のバリアントを使用して、一過性にトランスフェクトされたヒト細胞におけるゴルジ体常駐III型膜タンパク質間の異種相互作用の存在をチェックするための段階的なプロトコルについて説明しています。この手順は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)に対して最も広範囲に試験されていますが、N末端および/またはC末端が細胞質に面している他のゴルジ常駐III型膜タンパク質についても肯定的な結果を得ることができました。
我々の研究グループは、巨大分子のグリコシル化におけるNSTの役割を探究している。NSTはゴルジ体および/またはER常駐III型膜タンパク質であり、N末端およびC末端はオルガネラー膜の細胞質側を向いています1。NSTは、糖転移酵素に基質を供給するために、オルガネラ膜を横切ってヌクレオチド活性化糖を運ぶと考えられている。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマー2、3、4、5、6、7、8、9、10を形成する。さらに、異なるNST間の異種相互作用も報告されている6,11。NSTはまた、機能的に関連するグリコシル化酵素との複合体を形成することが実証された12、13、14。私たちは、NSTと機能的に関連するゴルジ体常駐タンパク質の相互作用を研究するために、現在使用されている蛍光寿命イメージング(FLIM)ベースのFRETアプローチに代わるものを探し、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイをテストすることに決めました。これにより、NSTと機能的に関連するグリコシル化酵素との間の新しい相互作用を同定することができました9。
スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の改変であるNanoBiTは、ここで提示されたプロトコルで使用されています15。これは、2つの断片からのルシフェラーゼ酵素(例えば、NanoLuc)の再構成に依存している - 大きなBiTまたはLgBiTと呼ばれる大きなもの、17.6kDaのタンパク質、および小さなBiTまたはSmBiTと呼ばれる11個のアミノ酸のみで構成される小さなもの。目的の2つのタンパク質を相補的断片と融合させ、ヒト細胞株中で一過性に発現させる。2つの融合タンパク質が相互作用する場合、細胞透過性基質の添加時にその場で発光が生成される。これら2つの断片は、それらが融合している目的のタンパク質間の相互作用によって一緒にされない限り、それらが最小の親和性で会合するように最適化されている。
一般に、生物発光ベースの方法は、蛍光に基づく方法よりもいくつかの利点を有する。生物発光シグナルは、バックグラウンド発光がルシフェラーゼ由来のシグナルと比較して無視できる程度であるため、より高いシグナル対ノイズ比を有する16。対照的に、蛍光ベースのアプローチは、通常、自己蛍光の現象によって引き起こされる比較的高いバックグラウンドに苦しむ。その上、生物発光は蛍光よりも分析された細胞にとって有害性が低く、前者の場合のように試料を励起する必要はない。これらの理由から、インビボでPPIを研究するための生物発光アプローチは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)や二分子蛍光相補(BiFC)などの一般的に使用される蛍光法よりも競合します。
我々のプロトコールは、目的のタンパク質組み合わせについて得られた発光を、対照の組み合わせについて得られた発光に参照することに依存している。後者は、より大きな断片と融合された試験されたタンパク質の1つと、より小さな断片と融合された対照タンパク質(例えば、HaloTag)とを含む。後者は、哺乳類のタンパク質のいずれとも相互作用するとは予想されない細菌起源のタンパク質である。このタンパク質を対照として使用すると、分析されるゴルジ常駐タンパク質の対のトポロジーに制限が生じる。哺乳動物細胞ではこのタンパク質は細胞質内で合成されるので、目的の両方のタンパク質は少なくとも1つの細胞質尾部を有するべきである。
このアプローチは、PPIの初期スクリーニングに特に有用であり得る。これは、目的の融合タンパク質が、他のアプローチを適用するには単に不十分なレベルで発現される場合に、選択の方法となり得る。同様に、分割ルシフェラーゼ相補アッセイは、目的のタンパク質が高レベルで発現している場合に最良の選択肢となり得るが、これはそれらの細胞内局在化に悪影響を及ぼすか、または非特異的相互作用を強制することが知られている。より小さい断片は11個のアミノ酸しか有さないので、より大きなタグを使用するのが不可能である場合に分割ルシフェラーゼ相補アッセイを適用することができる。最後に、ここで提示する場合のように、他の技術を用いて得られたデータをさらに確認するために採用することができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adherent mammalian cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium dedicated to the cell line used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT MCS Starter System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Live Cell Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2011</td>
			<td>This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oribital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of heterologous complexes formed by golgi-resident type iii membrane proteins using split luciferase complementation assay

このプロトコルの目的は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)によって形成される異種複合体を実証するためのスプリットルシフェラーゼ相補の最新の変異体の適用可能性を探索することである。これらのERおよびゴルジ常駐多膜貫通タンパク質は、細胞質的に合成されたヌクレオチド糖を細胞小器官膜全体に運び、グリコシル化を媒介する酵素を基質とともに供給する。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマーとして存在する。異なるNST間の異種相互作用も報告されている。この技術がNSTヘテロマー化の現象の研究に適しているかどうかを検証するために、我々は以前にいくつかの他の手段によって会合することが示された2つのゴルジに常駐するNSTの組み合わせに対してそれを試験した。ルシフェラーゼ相補アッセイは、高い発現レベルを必要とせず、しばしばタンパク質の誤局在化を引き起こし、偽陽性のリスクを高めるため、ゴルジ体常在性膜タンパク質間の相互作用の研究に特に適しているようである。

このアプローチで最も信頼性の高いデータを取得するには、考えられるすべての組み合わせをテストする必要があります ( 図 1 参照)。並行して、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含める必要があります。ポジティブコントロールは、相互作用することが知られている2つのタンパク質からなるべきであり、そのうちの1つは大きなフラグメントと融合?...

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Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

ここで提示されたプロトコルは、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の変異体を用いて、生きた哺乳動物細胞におけるゴルジ常駐III型膜タンパク質と細胞質的に露出したN末端および/またはC末端との間の異種相互作用の発生を実証することを意図している。

スプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いたゴルジレジデントIII型膜タンパク質によって形成される異種複合体の実証

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Our protocol allows to identify and analyze interactions between multi transmembrane proteins of the endoplasmic reticulum and golgi complex in living cells at low expression levels. The main advantage of this technique is it's to special sensitivity, which allows to avoid high over expression levels that are often detrimental to cellular health and may disturb protein subcellular localization. Harvest the adherent HEK293 T-cell culture by trypsinization and re-suspend the cells in a dedicated complete growth medium.Plate the cells onto a clear bottom, white side 96-well plate. Adjust the total number of wells to accommodate all tested combinations and controls, including replicates. Then, culture the cells overnight in standard conditions.On the next day, transfect the cells with the desired combinations of expression plasmids. Dilute the plasmids in a serum-free medium to 6.25 nanograms per microliter for each construct and add the lipid-based transfection reagent. Add an appropriate lipid to DNA ratio.Incubate the plasmids according to manufacturer's instruction. Then, add eight microliters of the lipid DNA mixture to the designated wells. Mix the content of the plate with gentle rotation and culture the cells for 20 24 hours in standard conditions.On the next day, replace the conditioned medium in each well with 100 microliters of a serum-free medium, making sure that the cells do not detach upon medium exchange. Just before measuring luminescence, mix one volume of furimazine with 19 volumes of a dilution buffer. Add 25 microliters of the furimazine working solution into each well, and gently mix the plate by hand or with a orbital shaker.Insert the plate into a luminescence micro plate reader and equilibrate the plate at 37 degrees Celsius for 10 15 minutes. Select the wells to be analyzed and read luminescence with an integration time of 0.3 seconds. Continue to monitor luminescence for up to two hours when required.This protocol was tested on two nucleotide sugar transporters, SLC35A2 and SLC35A3, which are golgi-resident type three membrane proteins with N and C termini facing the cytoplasm. There were eight possible tagging options and the resulting fusion proteins could be set together in eight possible ways. Mean relative luminescence units or RLU values corresponding to all the tested and control combinations are shown here.The RLU values obtained for three of the combinations were significantly higher than those obtained for the corresponding control combination. To obtain ratio values for the combinations of interest, the RLU values were divided by the RLU values obtained for the respective controls. Ratios between 10 and 1000 are highly indicative of specific interactions.There were two such combinations supporting the idea that SLC35A2 and SLC35A3 interact. To confirm this data, HA tagged SLC35A2 or SLC35A3 were co-expressed with the combination that resulted in the highest relative luminescence. Varying amounts of the plasmids and coding HA tagged NST variants were used for co-transfection, resulting in a statistically significant dose dependent decrease in RLU values.The most critical thing is to tackle your protein self interest in all possible ways and to assay all possible combination, as some tagging orientation may produce false negative results. Once the best performing combination has been selected, the dynamics of the corresponding interaction can be monitored to, for example identify agents or conditions that disrupt your complex of interest over time.

Research

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