Name: demonstration of heterologous complexes formed by golgi-resident type iii membrane proteins using split luciferase complementation assay
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay at JoVE.com

Bu çalışma, Polonya'nın Krakow kentindeki Ulusal Bilim Merkezi'nden (NCN) 2016/23/D/NZ3/01314 no'lu hibe ile desteklenmiştir.

1. İfade plazmidlerinin oluşturulması
<ol><li>Bir topoloji tahmin aracı kullanarak ilgilenilen proteinlerin membran topolojisini inceleyin.</li>
	<li>Klonlama stratejisini, füzyon proteinleri Golgi membranlarına yerleştirildikten sonra daha büyük ve daha küçük fragmanların sitoplazmaya bakacağı şekilde tasarlayın. Burada sunulan örnekte olduğu gibi, ilgili proteinlerin hem N- hem de C-termini sitoplazmik olarak yönlendirilmişse, proteinleri sekiz olası şekilde etiketleyin (bkz. <strong class="xfi...

<ol>
	<li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters:+Current+progress.">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li><li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution,+identification,+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter.">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li><li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter.">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li><li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum.">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li><li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line.">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li><li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane.">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li><li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation.">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li><li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer.">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).</li><li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1,4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT.">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).</li><li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous,+multi-specific,+hexameric+complex+of+LPG2+subunits.">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li><li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4.">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li><li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose:ceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum.">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li><li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+(SLC35A2)+and+UDP-N-acetylglucosamine+(SLC35A3)+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+(Mgats).">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li><li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo.">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals.">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li><li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs.">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li><li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes.">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li><li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+(TUBEs).">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li><li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization.">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li><li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+(NanoBiT).">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275 (2020).</li><li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time.">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li></ol>

Burada, bölünmüş lusiferaz kompleman testi kullanılarak NST'ler gibi Golgi'de yerleşik tip III membran proteinleri arasında oluşan heterolog komplekslerin gösterilmesini sağlayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Veri analizi ve yorumlanması için önerilen yaklaşım, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansın, daha büyük parça ile kaynaşmış ilgili proteinlerden birinden ve daha küçük parça ile kaynaşmış bir bakteri kökenli kontrol proteininden oluşan karşılık gelen...

Bu makalede, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, geçici olarak transfekte edilmiş insan hücrelerinde Golgi'de yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin varlığını kontrol etmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Prosedür, nükleotid şeker taşıyıcılarına (NST'ler) karşı en kapsamlı şekilde test edilmiştir, ancak N- ve / veya C-termini sitoplazmaya bakan diğer Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri için de olumlu sonuçlar elde edebildik.
Araştırma grubumuz, NST'lerin makromoleküllerin glikozilasyonundaki rolünü araştırmaktadır. NST'ler, organellar membranın sitoplazmik tarafına bakan N- ve C-termini ile Golgi ve/veya ER'de yerleşik tip III membran proteinleridir1. NST'lerin, glikoziltransferazları substratlarıyla beslemek için nükleotid ile aktive olmuş şekerleri organel zarları boyunca taşıdığı düşünülmektedir. NST'ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler oluşturur2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ayrıca, farklı NST'ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir6,11. NST'lerin fonksiyonel olarak ilişkili glikozilasyon enzimleri ile kompleksler oluşturduğu da gösterilmiştir12,13,14. NST'lerin ve fonksiyonel olarak ilişkili Golgi'de yerleşik proteinlerin etkileşimlerini incelemek için günümüzde kullanılan floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM) tabanlı FRET yaklaşımına bir alternatif aradık, bu yüzden bölünmüş lusiferaz kompleman testini test etmeye karar verdik. Bir NST ile fonksiyonel olarak ilişkili bir glikozilasyon enzimi arasındaki yeni bir etkileşimi tanımlamamızı sağladı9.
Bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son modifikasyonu olan NanoBiT, burada sunulan protokolde kullanılmaktadır15. Lusiferaz enziminin (örneğin, NanoLuc) iki parçadan yeniden yapılandırılmasına dayanır - büyük BiT veya LgBiT olarak adlandırılan büyük olanı, 17.6 kDa'lık bir protein ve küçük BiT veya SmBiT olarak adlandırılan sadece 11 amino asitten oluşan küçük olanı. İlgilenilen iki protein, tamamlayıcı parçalarla kaynaştırılır ve geçici olarak bir insan hücre hattında ifade edilir. İki füzyon proteini etkileşime girerse, hücre geçirgen bir substratın eklenmesiyle in situ olarak bir lüminesans üretilir. Bu iki parça, kaynaştıkları ilgili proteinler arasındaki bir etkileşimle bir araya getirilmedikleri sürece minimum afinite ile ilişkilendirilmeleri için optimize edilmiştir.
Genel olarak, biyolüminesans bazlı yöntemlerin floresan bazlı yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Biyolüminesan sinyaller daha yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahiptir, çünkü arka plan lüminesansı lusiferaz kaynaklı sinyale kıyasla ihmal edilebilir16. Buna karşılık, floresan temelli yaklaşımlar genellikle otofloresan fenomeninin neden olduğu nispeten yüksek bir arka plandan muzdariptir. Ayrıca, biyolüminesans, analiz edilen hücrelere floresandan daha az zararlıdır, çünkü eski durumda numuneyi uyarmaya gerek yoktur. Bu nedenlerden dolayı, PPI'ları in vivo olarak incelemeye yönelik biyolüminesan yaklaşımlar, Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) veya Bimoleküler Floresan Tamamlama (BiFC) gibi yaygın olarak kullanılan floresan yöntemlerden daha fazladır.
Protokolümüz, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansı, kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesansa yönlendirmeye dayanmaktadır. İkincisi, daha büyük bir parça ile kaynaşmış test edilen proteinlerden birini ve daha küçük bir parça ile kaynaşmış bir kontrol proteinini (örneğin, HaloTag) içerir. İkincisi, memeli proteinlerinin hiçbiriyle etkileşime girmesi beklenmeyen bakteriyel kökenli bir proteindir. Bu proteini bir kontrol olarak kullanmak, analiz edilecek Golgi'de yaşayan protein çiftlerinin topolojisinde sınırlamalar getirir. Memeli hücrelerinde bu protein sitoplazmada sentezlendiğinden, ilgilenilen her iki proteinin de en az bir sitoplazmik kuyruğu olmalıdır.
Bu yaklaşım, ÜFE'lerin ilk taraması için özellikle yararlı olabilir. İlgilenilen füzyon proteinleri, uygulanacak diğer yaklaşımlar için yetersiz olan seviyelerde ifade edildiğinde tercih edilen yöntem haline gelebilir. Benzer şekilde, bölünmüş lusiferaz kompleman testi, ilgili proteinler yüksek seviyelerde eksprese edilirse en iyi seçenek olabilir, ancak bu, hücre altı lokalizasyonlarını olumsuz yönde etkiler veya spesifik olmayan etkileşimleri zorladığı bilinmektedir. Daha küçük fragman sadece 11 amino aside sahip olduğundan, daha büyük etiketler kullanıldığında bölünmüş lusiferaz kompleman testi uygulanabilir. Son olarak, burada sunulan durumda olduğu gibi, diğer teknikler kullanılarak elde edilen verileri daha fazla doğrulamak için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adherent mammalian cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium dedicated to the cell line used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT MCS Starter System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Live Cell Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2011</td>
			<td>This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oribital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of heterologous complexes formed by golgi-resident type iii membrane proteins using split luciferase complementation assay

Bu protokolün amacı, nükleotid şeker taşıyıcıları (NST'ler) tarafından oluşturulan heterolog kompleksleri göstermek için bölünmüş lusiferaz komplemansiyonunun en son varyantının uygulanabilirliğini araştırmaktır. Bu ER ve Golgi'de yerleşik multitransmembran proteinleri, substratlarıyla glikozilasyona aracılık eden enzimleri sağlamak için sitoplazmik olarak sentezlenmiş nükleotid şekerlerini organel membranları boyunca taşır. NST'ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler olarak bulunur. Farklı NST'ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir. Tekniğin NST heteromerizasyonu fenomenini incelemek için uygun olup olmadığını doğrulamak için, daha önce birkaç başka yolla ilişkili olduğu gösterilen iki Golgi'de yerleşik NST'nin bir kombinasyonuna karşı test ettik. Lusiferaz kompleman testi, Golgi'de yerleşik membran proteinleri arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle uygun görünmektedir, çünkü genellikle protein yanlış lokalizasyonunu tetikleyen ve yanlış pozitif riskini artıran yüksek ekspresyon seviyeleri gerektirmez.

Bu yaklaşımda en güvenilir verileri elde etmek için tüm olası kombinasyonlar test edilmelidir (bkz. Şekil 1). Paralel olarak, pozitif ve negatif kontroller dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, etkileşime girdiği bilinen iki proteinden oluşmalıdır, bunlardan biri daha büyük parça ile kaynaştırılır ve diğeri daha küçük parça ile kaynaştırılır. Negatif kontrol ideal olarak, aynı şekilde etiketlenmiş iki etkileşimsiz tip III membran proteininden oluşmalıdır. Bun...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay at JoVE.com

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Our protocol allows to identify and analyze interactions between multi transmembrane proteins of the endoplasmic reticulum and golgi complex in living cells at low expression levels. The main advantage of this technique is it's to special sensitivity, which allows to avoid high over expression levels that are often detrimental to cellular health and may disturb protein subcellular localization. Harvest the adherent HEK293 T-cell culture by trypsinization and re-suspend the cells in a dedicated complete growth medium.Plate the cells onto a clear bottom, white side 96-well plate. Adjust the total number of wells to accommodate all tested combinations and controls, including replicates. Then, culture the cells overnight in standard conditions.On the next day, transfect the cells with the desired combinations of expression plasmids. Dilute the plasmids in a serum-free medium to 6.25 nanograms per microliter for each construct and add the lipid-based transfection reagent. Add an appropriate lipid to DNA ratio.Incubate the plasmids according to manufacturer's instruction. Then, add eight microliters of the lipid DNA mixture to the designated wells. Mix the content of the plate with gentle rotation and culture the cells for 20 24 hours in standard conditions.On the next day, replace the conditioned medium in each well with 100 microliters of a serum-free medium, making sure that the cells do not detach upon medium exchange. Just before measuring luminescence, mix one volume of furimazine with 19 volumes of a dilution buffer. Add 25 microliters of the furimazine working solution into each well, and gently mix the plate by hand or with a orbital shaker.Insert the plate into a luminescence micro plate reader and equilibrate the plate at 37 degrees Celsius for 10 15 minutes. Select the wells to be analyzed and read luminescence with an integration time of 0.3 seconds. Continue to monitor luminescence for up to two hours when required.This protocol was tested on two nucleotide sugar transporters, SLC35A2 and SLC35A3, which are golgi-resident type three membrane proteins with N and C termini facing the cytoplasm. There were eight possible tagging options and the resulting fusion proteins could be set together in eight possible ways. Mean relative luminescence units or RLU values corresponding to all the tested and control combinations are shown here.The RLU values obtained for three of the combinations were significantly higher than those obtained for the corresponding control combination. To obtain ratio values for the combinations of interest, the RLU values were divided by the RLU values obtained for the respective controls. Ratios between 10 and 1000 are highly indicative of specific interactions.There were two such combinations supporting the idea that SLC35A2 and SLC35A3 interact. To confirm this data, HA tagged SLC35A2 or SLC35A3 were co-expressed with the combination that resulted in the highest relative luminescence. Varying amounts of the plasmids and coding HA tagged NST variants were used for co-transfection, resulting in a statistically significant dose dependent decrease in RLU values.The most critical thing is to tackle your protein self interest in all possible ways and to assay all possible combination, as some tagging orientation may produce false negative results. Once the best performing combination has been selected, the dynamics of the corresponding interaction can be monitored to, for example identify agents or conditions that disrupt your complex of interest over time.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Biyoloji

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

Antikor Profil Lusiferaz Immunoprecipitation Sistemleri (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...