Name: controlled strain of 3d hydrogels under live microscopy imaging
Uploaded: 2020-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging at JoVE.com

Nogle tal, der er inkluderet her, er blevet tilpasset med tilladelse fra Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Belastende 3D hydrogels med ensartede z-aksestammer, samtidig med at der muliggøres levende mikroskopibilleddannelse, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

1. Løsningsforberedelse (skal udføres på forhånd)
<ol><li>Fibrinogen mærkning BEMÆRK: Mærkningstrinnet er kun påkrævet, hvis man ønsker at analysere deformationen af fibringelen. Til cellulære eksperimenter er det muligt at bruge en umærket gel.<ol>
<li>Der tilsættes 38 μL på 10 mg/mL succinimidylester fluorescerende farvestof (opløst i DMSO) til 1,5 ml 15 mg/mL fibrinogenopløsning (molarforhold på 5:1) i et 50 ml centrifugerør og anbringes på en shaker i 1 time ved stuetemperatur. Derefter place...

Den metode og protokol, der præsenteres heri, er i vid udstrækning baseret på vores tidligere undersøgelse af Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderer her det fulde computerstøttede design (CAD), Python og mikrocontrollerkoder på SCyUS-enheden.
De største fordele ved den præsenterede metode i forhold til eksisterende tilgange omfatter muligheden for at stamme meget bløde 3D hydrogels (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) fra deres omkreds, og under levende</e...

Vævsrespons på mekaniske kræfter er en integreret del af en lang række biologiske funktioner , herunder genekspression1, celledifferentiering2og vævsgenopbygning3. Desuden kan kraftinducerede ændringer i den ekstracellulære matrix (ECM) såsom fiberjustering og fortætning påvirke celleadfærd og vævsdannelse4,5,6. ECM's fibernetstruktur har spændende mekaniske egenskaber, såsom ikke-lineær elasticitet, ikke-affin deformation og plastdeformationer7,8,9,10,11,12. Disse egenskaber påvirker , hvordan celler og deres omgivende mikromiljø reagerer på eksterne mekaniske kræfter13,14. En forståelse af, hvordan ECM og væv reagerer på mekaniske kræfter, vil gøre det muligt at gøre fremskridt inden for vævsteknik og med hensyn til udvikling af mere nøjagtige beregningsmæssige og teoretiske modeller.
De mest almindelige metoder til mekanisk strækprøver har fokuseret på cellebelastede 2D-substrater for at udforske virkningerne på celleadfærd. Disse omfatter for eksempel at anvende belastning på polydimethylsiloxan (PDMS) substrater og analysere cellereorienteringsvinkler i forhold til strækretningen15,16,17,18,19. Men metoder, der undersøger reaktionen fra 3D-celle-indlejrede hydrogels til eksterne stretch, en situation, der i højere grad efterligner væv mikromiljø, er mere begrænset. Fremskridt mod 3D-stretchingmetoder er af særlig betydning, fordi celler opfører sig anderledes på 2D-substrater sammenlignet med 3D-matricer20. Disse adfærdsmønstre omfatter cellulær justering, proteinudtryksniveauer og migrationsmønstre21,22,23.
Metoder og anordninger , der gør det muligt at strække 3D-prøven , omfatter både kommercielt tilgængelige24,25,26,27,28 og dem,der er udviklet til laboratorieforskning29. Disse metoder bruger distensible silikonerør30, multibrøndkamre31, klemmer26,32, bioreaktorer11,33, cantilevers34,35,36og magneter37,38. Nogle teknikker genererer strækning, der lokalt deformerer 3D hydrogels, for eksempel ved at trække nåle fra to enkeltpunkter i gel5, mens andre giver mulighed for deformation af hele hovedparten af gel16. Desuden fokuserer de fleste af disse systemer på analyse af stammefeltet i X-Y-flyet med begrænsede oplysninger om belastningsfeltet i Z-retningen. Derudover er kun en håndfuld af disse enheder i stand til mikroskopisk in situ-billeddannelse. Den største udfordring med in situ højforstørrelse billeddannelse (f.eks confocal mikroskop) er den begrænsede arbejdsafstand på et par hundrede mikron fra den objektive linse til prøven. Enheder, der tillader levende billeddannelse under strækoffer ensartetheden af belastningen i Z-aksen eller er relativt komplekse og vanskelige at reproducere i andrelaboratorier 39,40. 
Denne tilgang til at strække 3D hydrogels giver mulighed for statisk eller cyklisk uniaxial stamme under levende konfokal mikroskopi. Strækenheden (kaldet 'Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS') er konstrueret ved hjælp af 3D-printede dele og billig hardware, hvilket gør det nemt at formere sig i andre laboratorier. Fastgjort til enheden er et kommercielt tilgængeligt silikonegummi med en geometrisk udskæring i midten. Hydrogel komponenter er polymeriseret til at fylde cut-out. Under polymerisering klæber biologiske hydrogeler, såsom fibrin eller kollagen, naturligt til de indvendige vægge i udskæringen. Ved hjælp af SCyUS er silikonestrimlen uniaxially strakt og overfører kontrollerede stammer til den indlejrede 3D hydrogel41.
Dette system giver mulighed for en unik kombination af funktioner og fordele sammenlignet med andre eksisterende metoder. For det første tillader systemet uniaxial strækning af tykke 3D bløde hydrogels (> 100 μm tyk, <1 kPa stivhed) fra deres periferi, med Z-homogendeformation i hele hydrogel. Disse hydrogels er for bløde til at blive grebet og strakt af konventionelle trækteknikker. For det andet kan strække enheden let replikeres i andre laboratorier, da 3D-udskrivning er let tilgængelig for forskere, og den elektronik, der bruges i designet, er billig. For det tredje, og måske den mest attraktive funktion, geometri og størrelsen af udskæringen i silikone strimlen let kan manipuleres, giver mulighed for tunable stamme gradienter og grænse betingelser samt brugen af en række prøve mængder, ned til et par mikroliter.
Den præsenterede protokol består af støbning fibrin gel i ~ 2 mm diameter diske i 0,5 mm tyk silikone gummi strimler udført af enaksial strækning under levende confocal mikroskopi. Følgende diskuterer i detaljer de eksperimentelle procedurer for måling og analyse af de stammer, der virker på den geometriske udskæring, de interne stammer udviklet i hydrogel, samt deraf følgende fiberjustering efter forskellige strækmanipulationer. Endelig diskuteres muligheden for at indlejre celler i hydrogelen og udsætte dem for kontrolleret ekstern strækning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Medium (DMEM High Glucose)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td>Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip #1.5</td>
			<td>Bar-Naor Ltd.</td>
			<td>BN72204-30</td>
			<td>22&#215;40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D-5879-500 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVICEL Fibrin Sealant (Human)</td>
			<td>Omrix Biopharmaceuticals</td>
			<td>3902</td>
			<td>Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride &#38; 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 &#181;m)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8820</td>
			<td>Orange (540/560) 
			Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3788T41</td>
			<td>580 &#181;m-thick 
			E = 1.5 Mpa 
			Poisson Ratio = 0.48 
			Tensile Strength = 4.8 MPa 
			Upper limit of stretch = +300% engineering strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1408-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>HIVAC-G 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ FIJI software39</td>
			<td>National Institute of Health, Bethesda, MD</td>
			<td>Version 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)</td>
			<td>Arduino/Adafruit</td>
			<td>Arduino-DK001/Adafruit-1438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroVL 21R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert Light Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.</td>
			<td>491206-0011-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCyUS CAD (Solidworks)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCyUS Code37</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servomotor - TowerPro SG-5010</td>
			<td>Adafruit</td>
			<td>155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td>For 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm non-culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cable (Type B Male to Type A Male)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 Confocal Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>2811000417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>Release Version 14.0.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled strain of 3d hydrogels under live microscopy imaging

Eksterne kræfter er en vigtig faktor i vævsdannelse, udvikling og vedligeholdelse. Virkningerne af disse kræfter studeres ofte ved hjælp af specialiserede in vitro-stretching metoder. Forskellige tilgængelige systemer bruger 2D substrat-baserede bårer, mens tilgængeligheden af 3D-teknikker til at belaste bløde hydrogels, er mere begrænset. Her beskriver vi en metode, der tillader ekstern strækning af bløde hydrogels fra deres omkreds ved hjælp af en elastisk silikonestribe som prøvebærer. Det strækningssystem, der bruges i denne protokol, er konstrueret af 3D-printede dele og billig elektronik, hvilket gør det enkelt og nemt at replikere i andre laboratorier. Den eksperimentelle proces begynder med polymerisering tyk (> 100 μm) bløde fibrin hydrogels (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) i en udskæring i midten af en silikone strimmel. Silikone-gel konstruktioner er derefter fastgjort til den trykte-stretching enhed og placeres på confocal mikroskop fase. Under levende mikroskopi aktiveres strækkeenheden, og gelerne afbildes på forskellige strækstyrker. Billedbehandling bruges derefter til at kvantificere de resulterende gel deformationer, der viser relativt homogene stammer og fiberjustering i hele gelens 3D-tykkelse (Z-akse). Fordelene ved denne metode omfatter evnen til at belaste ekstremt bløde hydrogels i 3D, mens du udfører in situ mikroskopi, og friheden til at manipulere geometri og størrelse af prøven i henhold til brugerens behov. Derudover kan denne metode med korrekt tilpasning bruges til at strække andre typer hydrogeler (f.eks. kollagen, polyacrylamid eller polyethylenglycol) og kan give mulighed for analyse af celler og vævsrespons på eksterne kræfter under mere biomimetiske 3D-forhold.

I figur 9er repræsentative data fra statiske stræk af stigende størrelsesordener anvendt på silikonestrimlen med en 3D-fibrinhydrogel, indlejret med 1 μm fluorescerende perler . Analysen viser effekten af silikone stretch på geometriske ændringer af cut-out samt de udviklede stammer i gelen. Z-stakbilleder af hele gel bruges til at evaluere deformationen af den oprindelige cirkel formet cut-out til elliptisk geometri (Figur 9A). Disse bi...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging at JoVE.com

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

Den præsenterede metode indebærer uniaxial strækning af 3D bløde hydrogels indlejret i silikone gummi og samtidig tillade levende confocal mikroskopi. Karakterisering af de eksterne og interne hydrogelstammer samt fiberjustering demonstreres. Den udviklede enhed og protokol kan vurdere cellernes reaktion på forskellige stammeregimer.

Kontrolleret stamme af 3D Hydrogels under Live Mikroskop imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

Magnetisk Assisted Fjernstyret mikrokateteret Tip Nedbøjning under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogeler fra Pulmonal ekstracellulære matrix for 3D cellekultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisere angiogenese af Multiphoton mikroskopi In Vivo i genetisk modificerede 3D-PLGA/nHAp stillads til Calvarial kritiske knogle defekt reparation

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Produktionen af Elastin-lignende Protein Hydrogels til indkapsling og immunfarvning af celler i 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedhæftning dannelse i celler ved hjælp af avancerede Spinning Disk-Total interne Reflection Fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Måling af Global cellulære Matrix Metalloproteinase og metaboliske aktivitet i 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

High-Resolution Imaging af nuklear dynamik i levende celler under Uniaxial træk stamme

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Karakterisering single-molekyle konformationændringer under forskydning flow med fluorescens mikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

En brugerdefineret multifoton mikroskopi platform for Live Imaging af mus hornhinde og konjunktiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...