Name: conjunctival commensal isolation and identification in mice
Uploaded: 2021-05-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice at JoVE.com

دعم التمويل من P30 DK034854 VY وLB والدراسات في مركز ماساتشوستس المضيف الميكروبيوم والتمويل من NIH / NEI R01 EY022054 دعم MG.

تتبع جميع الإجراءات التي تشمل الفئران المبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات. اتبع إرشادات السلامة المختبرية (وفقا لتوجيهات إدارة الصحة والسلامة البيئية المؤسسية) عند العمل مع الكائنات الحية الدقيقة والمواد التي يحتمل أن تكون ملوثة. استخدام أوعية النفايات المنا?...

<ol>
	<li>Arpaia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+produced+by+commensal+bacteria+promote+peripheral+regulatory+T+cell+generation.">Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation.</a> Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).</li><li>Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+microbiota+and+the+immune+system.">Interactions between the microbiota and the immune system.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-origin+probiotic+cocktail+increases+short+chain+fatty+acid+production+via+modulation+of+mice+and+human+gut+microbiome.">Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).</li><li>Graham, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+pathogen+or+commensal:+a+PCR+based+study+of+surface+bacterial+flora+in+normal+and+dry+eyes.">Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren-Like+Lacrimal+Keratoconjunctivitis+in+Germ-Free+Mice.">Sj&#246;gren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).</li><li>Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+ocular+microbial+communities+in+diabetic+patients+compared+with+healthy+subjects.">Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects.</a> Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).</li><li>Doan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paucibacterial+microbiome+and+resident+DNA+virome+of+the+healthy+conjunctiva.">Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).</li><li>Kugadas, A., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+microbiome+on+ocular+health.">Impact of microbiome on ocular health.</a> Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).</li><li>Dong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+bacteria+at+healthy+human+conjunctiva.">Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).</li><li>Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+understanding+the+ocular+surface+microbiome.">Considerations in understanding the ocular surface microbiome.</a> American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).</li><li>Fleiszig, S. M., Efron, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+flora+in+eyes+of+current+and+former+contact+lens+wearers.">Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers.</a> Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+L-Plastin+Controls+Ocular+Paucibacteriality+and+Susceptibility+to+Keratitis.">Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).</li><li>Johnson, T. R., Case, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).</li><li>Reiner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalase+Test+Protocol.">Catalase Test Protocol.</a> American Society for Microbiology. , (2010).</li><li>UK SMI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).</li><li>Sharp, S. E., Searcy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mannitol+salt+agar+and+blood+agar+plates+for+identification+and+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus+in+specimens+from+cystic+fibrosis+patients.">Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).</li><li>Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milleri+group+streptococcus--a+stepchild+in+the+viridans+family.">Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family.</a> European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).</li><li>Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerococcus+Viridans:+A+Rare+Pathogen+Causing+Urinary+Tract+Infection.">Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).</li><li>Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+is+a+sensitive+and+specific+method+for+identification+of+aerococci.">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).</li><li>Wan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1R+and+MyD88+contribute+to+the+absence+of+a+bacterial+microbiome+on+the+healthy+murine+cornea.">IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).</li><li>Ozkan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Stability+and+Composition+of+the+Ocular+Surface+Microbiome.">Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).</li><li>Oliver, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viable+but+non-culturable+state+in+bacteria.">The viable but non-culturable state in bacteria.</a> Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).</li><li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenomenon+of+microbial+uncultivability.">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).</li><li>Whelan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-enriched+metagenomic+sequencing+enables+in-depth+profiling+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiota.">Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota.</a> Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).</li><li>Raymond, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-enriched+human+gut+microbiomes+reveal+core+and+accessory+resistance+genes.">Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes.</a> Microbiome. 7, 56 (2019).</li><li>Peto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+enrichment+and+sequencing+of+feces+to+enhance+detection+of+antimicrobial+resistance+genes+in+third-generation+cephalosporin+resistant+Enterobacteriaceae.">Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae.</a> PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).</li><li>Lauer, B. A., Masters, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effect+of+calcium+alginate+swabs+on+Neisseria+gonorrhoeae.">Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).</li><li>Dubois, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+the+Vitek+MS+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+system+for+rapid+identification+of+bacteria+in+routine+clinical+microbiology.">Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).</li><li>Kawakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=double-blind+study+of+the+safety+and+Efficacy+of+1%D-3-Hydroxybutyrate+eye+drops+for+Dry+Eye+Disease.">double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease.</a> Scientific Reports. 6, 20855 (2016).</li><li>Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+toll-like+receptor+4+contributes+to+corneal+inflammation+in+experimental+dry+eye+disease.">Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).</li><li>Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+to+lipopolysaccharide+on+the+ocular+surface+in+a+murine+dry+eye+model.">Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).</li><li>Miller, D., Ioviano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microbial+flora+on+the+ocular+surface.">The role of microbial flora on the ocular surface.</a> Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).</li><li>Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+epigenetic+changes+caused+by+commensal+microbiota+contribute+to+development+of+ocular+disease?+A+review+of+evidence.">Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence.</a> Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).</li><li>Stevenson, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+disease:+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder.">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).</li></ol>

بسبب الحالة البكتيرية للسطح العيني ، واجهت العديد من المختبرات صعوبة في عزل commensals العين7،20، مما أدى إلى انخفاض عدد العينات مع النمو وانخفاض وفرة وانخفاض التنوع8. هذه الطريقة تحسن بشكل كبير على الممارسات التقليدية الثقافة4،<su...

الهدف من هذا البروتوكول هو تعزيز عزلة محددة من الميكروبات الهوائية والكلية غير الهوائية القابلة للحياة والنادرة من الملتحمة العينية لتوصيف الميكروبيوم العيني. وقد عرضت دراسات مستفيضة المجتمعات المخاطية كومينسال على الجلد والأمعاء والجهاز التنفسي والأعضاء التناسلية وتبين أن هذه المجتمعات تؤثر على تطور الجهاز المناعي والاستجابة1و2و3. وقد ثبت أن المجتمعات commensal العين لتغيير خلال أمراض معينة، مثل مرض جفاف العين4، متلازمةشيغرن5 ومرض السكري6. ومع ذلك ، فإن القدرة على تحديد مجتمع كومينسال سطح العين النموذجي يعوقها وفرة منخفضة نسبيا مقارنة مع غيرها من المواقع المخاطية6،7،8. وهذا يثير جدلا حول ما إذا كان هناك ميكروبيوم العين المقيم وإذا كان موجودا، ما إذا كان يختلف عن ميكروبيوم الجلد وبالتالي، تأثيره المحلي على تطوير الجهاز المناعي الفطري والاستجابة. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في حل هذه المسألة.
عموما، تستند النهج لتحديد مكانة commensal العين على التسلسل والتقنيات القائمة على الثقافة4،7،9. 16 S rDNA التسلسل وتحليل BRISK7 تظهر تنوعا أوسع من التقنيات القائمة على الثقافة، ولكن غير قادرين على التفريق بين الميكروبات الحية والميتة. نظرا لأن سطح العين معاد للعديد من الميكروبات بسبب خصائص الفيلم المسيل للدموع المضادة للميكروبات4 التي تولد مجموعة كبيرة من شظايا الحمض النووي ، فإن النهج القائمة على الحمض النووي ستكتشف هذه القطع الأثرية التي قد تحرف البيانات نحو تحديد البكتيريا الميتة ككومينسالات مقيمة بدلا من الملوثات. وهذا يؤدي إلى تحديد commensal شاذة وتوصيف الفضاء العين بأنها أعلى في وفرة الميكروبات والتنوع10. وهذا يجعل من الصعب تحديد الميكروبيوم العيني المقيم عن طريق الأساليب القائمة على الحمض النووي. حيث أن التقنيات المستندة إلى الثقافة القياسية غير قادر على الكشف عن commensals لأن التحميل منخفض جدا11. أسلوبنا يحسن على الممارسات القياسية باستخدام مسحة رقيقة التي يمكن أن تستهدف الملتحمة، وبالتالي تجنب التلوث من الجلد المجاور، فضلا عن مفهوم أن الكائنات الحية قابلة للحياة يمكن إثراء من قبل ثقافة قصيرة في وسائل الإعلام الغنية بالمغذيات بهدف إحياء قابلة للحياة ولكن غير قابلة للتكريس، فضلا عن إثراء للميكروبات نادرة قابلة للحياة.
النتائج، وفرة نسبية من commensals العين لكل مسحة العين، تميز الميكروبيوم المقيم الملتحمة ومهمة لأغراض المقارنة. تظهر بياناتنا أن هناك فرقا بين الجلد والميكروبات الملتحمة ، بالإضافة إلى تنوع أكبر مع زيادة العمر والفرق المحدد للجنس في الوفرة. وعلاوة على ذلك ، فقد وجد هذا النهج بشكل مستنسخ اختلافات كومينسال في الفئرانالمغلوبة 12. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لوصف الميكروبيوم العيني الذي قد يختلف بسبب ممارسات التكتكة أو الجغرافيا أو حالة المرض ، وكذلك الآثار المحلية لمييضات ومنتجات commensal على تطوير الجهاز المناعي والاستجابة له.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 to 10 &#181;l pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1110-300</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 to 10 &#181;l Eppendorf pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD309623</td>
			<td>1 syringe for each eye swab group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181; ml pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2021</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 to 1000&#181;l Gilson pipetman (P1000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>1 needle per eye swab group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 % Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176; C Incubator</td>
			<td>Lab equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 % Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PX1840-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)</td>
			<td>Santa Cruz Animal Health</td>
			<td>SC-362949Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BBL Gram Stain kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Lab equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean paper towels</td>
			<td>Lab equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Batting/Sterile rolled cotton</td>
			<td>CVS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>for Gram stain and catalase tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>ATCC 8739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>for Gram stain and catalase tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (100mg/ml)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9950001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey Agar Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4321270</td>
			<td>store at 4 &#176;C until ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol Salt Agar</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>784641</td>
			<td>Prepare plates according to mfr&#39;s instructions, store at 4 &#176;C for 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57/BL6J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
			<td>for Mannitol Salt agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPI Brain Heart Infusion Media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-488525</td>
			<td>prepare according to directions and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteriFlip (0.22 &#181;m pore size polyester sulfone)</td>
			<td>EMD/Millipore, Fisher Scientifc</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>to sterilize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>anesthesia preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile mouse cage</td>
			<td>Lab equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth picks (round bamboo)</td>
			<td>Kitchen Essentials</td>
			<td></td>
			<td>autoclave before use and swab preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep&#39;s Blood Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4321261</td>
			<td>store at 4 &#176;C until ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitek target slide</td>
			<td>BioMerieux Inc. Durham,NC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitek-MS</td>
			<td>BioMerieux Inc. Durham,NC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitek-MS CHCA matrix solution</td>
			<td>BioMerieux Inc. Durham, NC</td>
			<td>411071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single use eye drops</td>
			<td>CVS Pharmacy</td>
			<td></td>
			<td>Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conjunctival commensal isolation and identification in mice

كان سطح العين يعتبر ذات مرة محصنا متميزا وغير أحيائيا ، ولكن يبدو مؤخرا أن هناك وجودا صغيرا ، ولكن مستمرا. وقد كان تحديد ورصد الأنواع البكتيرية في الغشاء المخاطي العيني تحديا بسبب وفرة منخفضة وتوافر محدود من المنهجية المناسبة لنمو commensal وتحديد. هناك نهجان قياسيان: الثقافة القائمة أو أساليب تسلسل الحمض النووي. الطريقة الأولى هي إشكالية بسبب البكتيريا القابلة للاسترداد محدودة والنهج الثاني يحدد البكتيريا الحية والميتة على حد سواء مما يؤدي إلى تمثيل شاذ من الفضاء العين. طورنا طريقة قوية وحساسة للعزل البكتيري من خلال البناء على تقنيات الاستزراع الميكروبيولوجي القياسية. هذه تقنية تعتمد على المسحة ، باستخدام مسحة رقيقة مصنوعة من "المختبر" تستهدف الملتحمة السفلية ، تليها خطوة تضخيم للأجناس اللاهوائية الهوائية والكلية. وقد سمح لنا هذا البروتوكول لعزل وتحديد الأنواع الملتحمة مثل Corynebacterium spp., Coagulase المكورات العنقودية السلبية spp., العقدية spp. هذا النهج هو مناسبة لتحديد التنوع commensal في الفئران في ظل ظروف المرض المختلفة.

تظهر النتائج التمثيلية للوحة مسحة العين التي تظهر أساليب مختلفة للطلاء في الشكل 3A تظهر عزلات متنوعة شكليا من الماوس C57BL/6. لكل عزلة متميزة، تم عد المستعمرات في القطاع والوفرة النسبية، وحدات تشكيل مستعمرة فريدة من نوعها (CFUs) لكل مسحة عين، محسوبة ورسمت لأغراض المقارنة. لتوصيف...

Watch this Scientific Journal Video about Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice at JoVE.com

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

يقدم هنا بروتوكول لعزل وتضخيم البكتيريا اللاهوائية الهوائية والكلية الملتحمة الماوس الملتحمة باستخدام مسحة عين فريدة من نوعها وخطوة إثراء قائمة على الثقافة مع تحديد لاحق من خلال الأساليب القائمة على الميكروبيولوجية وقياس الطيف الكتلي MALDI-TOF.

عزل الملتحمة والهوية في الفئران

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

تحدد هذه الطريقة الكائنات الدقيقة الملتحمة العينية القابلة للتطبيق ، والتي تشكل تحديا بسبب بيئة العينين العدائية. يمكن أن يساعد في الإجابة عما إذا كان يوجد ميكروبيوم العين وكيف يتغير الوجود البكتيري في مرض العين. وعلى النقيض من تسلسل الحمض النووي، الذي يحدد الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة على حد سواء، فإن هذه الطريقة تحدد الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة فقط، مما يؤدي إلى فهم أوضح لمجتمع كومنسال العين.تشير الدراسات إلى أنه من الصعب تشخيص أمراض العين مثل عدم المناعة الذاتية وجفاف العين المناعية الذاتية لها وجود بكتيري عين فريد. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتشخيص أمراض العين مع التوقيعات الميكروبية المميزة. تبدأ عن طريق autoclaving الكمية المناسبة من القطن الضرب ومسواك لعدد الفئران التي سيتم مسحها، ثم قرصة قبالة قطعة طويلة سنتيمتر واحد من الضرب القطن وندف بها عن طريق سحب على حواف لتشكيل طبقة واحدة مسطحة مسامية وقف قبل الضرب ينهار.دوامة الضرب حول واحدة من النهايات الحادة للمسنك عن طريق عقد طفيفة قطعة امتدت على طرف مسواك كما هو الملتوية. مسحة العين النهائية سيكون لها طبقة رقيقة جدا من القطن امتدت على طرف تمتد ما يقرب من 1/2 إلى سنتيمتر واحد بعيدا عن الطرف. إدراج مسحات في كوب صغير، مسحة الجانب إلى أسفل ثم تغطية وautclave لهم.تنظيف منطقة العمل مع مطهر للحد من التلوث وaliquot 0.5 ملليلتر من ضخ قلب الدماغ العقيمة، أو وسائل الإعلام BHI في المسمى 1.5 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي الصغيرة العقيمة. قم بوضع الأنابيب في رف ووضع الرف على الجليد. إعداد سير العمل من اليسار إلى اليمين بدءا من محطة تخدير الماوس، والذي يحتوي على القفص مع الفئران التجريبية، قفص عقيم فارغ، تخدير درجة حرارة الغرفة، إبرة قياس 25 وحقنة ملليلتر واحد.بعد ذلك ، قم بإعداد محطة مسح العين التي تحتوي على BHI المقتبس على الجليد ، ومسحات العين المعقمة ، وقطرات العين التشحيم ، وحاوية المخاطر البيولوجية ، والمناشف الورقية النظيفة ، ورذاذ الأيزوبروبانول بنسبة 70٪. وأخيرا، قم بإعداد محطة الطلاء مع لوحات أجار الدم درجة حرارة الغرفة، ماصة 10 ميكرولتر، 10 نصائح الميكرولتر القابل للتصرف العقيمة، وحاوية النفايات الخطرة بيولوجيا. تأكد من أن يتم تخدير الماوس بشكل صحيح عن طريق الضغط على لوحة القدم الخلفية.فقط المضي قدما إذا لم يكن هناك حركة. تعيين يد واحدة للتعامل مع الفئران تخدير والأيدي الأخرى للتعامل مع مسحة العين والثقافة. إزالة الماوس من القفص ووضعه على رأس سطح العمل المتمركزة على جانبها مع العين اليسرى المكشوفة.رش اليدين القفازين مع الأيزوبروبانول وجففها بمنشفة ورقية. فك أنبوب الطرد المركزي الصغير BHI المسمى مع يد معالجة الوسائط المخصصة ووضع الاثنين مرة أخرى في الحامل. تراجع طرف القطن المغلفة من مسحة العين في BHI، ثم سحب مسحة من الأنبوب في حين يحوم الطرف مرتين ضد الأنبوب الداخلي لإزالة السائل الزائد وإزالتها.مع يد الماوس التعامل مع، عقد بلطف الماوس من قبل scruff من الرقبة. مع اليد الأخرى، ضع طرف مسحة العين ضد المنطقة الملتحمة الوسيطة للعين اليسرى. الاكتئاب طفيفة مقلة العين وتحريك مسحة في نافذة غسل الحركة بين الجفن السفلي والعين 10 مرات، والحفاظ على الضغط المستمر.دون لمس الفراء، وإزالة بلطف غيض من مسحة عمودي إلى حيث تم إدراجها. ضع جانب القطن المسحة لأسفل ، مباشرة في أنبوب طرد مركزي صغير مع وسائط BHI. ضعي قطرة عين على العين المسحة.إذا رغبت في ذلك، والحصول على مسحات الجلد أو الفراء لعينات التحكم، وتعقيم قفازات بشكل مناسب بين كل مسحة. عند الانتهاء، أعد الماوس إلى القفص. دع المسحة تقف لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد ، ثم تعقيم اليدين القفازتين وإزالة المسحة أثناء خلط الطرف في الوسائط لمدة 10 دورات.سحب مسحة عن طريق تدوير طرف ضد الجدار الداخلي للأنبوب لمدة خمس دورات والتخلص منه في حاوية المخاطر البيولوجية. كرر العملية لكل ماوس. إثراء العينة عن طريق احتضان الأنبوب بشكل ثابت لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.أثناء الحضانة، تسمية لوحة TSA درجة حرارة غرفة واحدة لكل مسحة عين الماوس أو مسحة التحكم وتقسيمها إلى نصفين. إزالة عينات المخصب من الحاضنة ووضعها على الجليد. دوامة لفترة وجيزة العينات لخلط، ثم aliquot 10 ميكرولتر من العينة على لوحة TSA وإمالة لوحة لتشكيل قطاع.كرر هذا مرتين. على الجانب الآخر من الخط الفاصل لوحات، وخلق 10 نقاط مع 10 ميكرولتر من عينة لكل منهما. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة، يومين وأربعة أيام في غرفة نظيفة تمنع لوحات أجار من التجفيف.عد المستعمرات في الشرائط. لاحظ مورفولوجيا وحساب وحدات تشكيل مستعمرة لكل مسحة لعزلات مماثلة شكليا. انظر إلى النقاط التي لا يتم فيها التقاط كائنات فريدة في الشرائط.لتسهيل التصور، قمنا بطلاء البكتيريا بكثافة في الصفائح الوسطى والأيسر. عادة، لاحظنا بكتيريا أقل بكثير في لوحات مسحة العين. لاحظ أنه في بعض الأحيان ، قد لا تسفر مسحات العين عن بكتيريا قابلة للاسترداد.تظهر هنا لوحة مسحة عين تمثيلية مع عزلات متنوعة شكليا من فأر أسود من C57. لكل عزلة متميزة، تم عد المستعمرات في القطاع وتم حساب الوفرة النسبية ورسمها. لتوصيف الميكروبيولوجية، تم انتقاؤها البكتيريا من لوحات مسحة عين الفأر الفردية لإنتاج لوحة TSA الرئيسية.عندما ظهر النمو، تم إجراء اختبارات إضافية لتوصيف أو تحديد الميكروبات. تم استخدام اللوحة الرئيسية لتوفير ما يكفي من inoculum لتوسيع العزلات المعنية. ولتحديد العزلات، تم تناثر لوحة TSA واحتضانها بين عشية وضحاها، وتم إجراء مرض التصلب المتعدد MALDI-TOF.تم تحديد أمثلة من العزلات الموضحة هنا باسم المكورات العقدية اسيدومينيموس وإيروكوكوس viridans. تم استرداد مستويات مختلفة بشكل ملحوظ من الكائنات العضوية من الذكور والإناث C57 الأسود ستة فئران. تم عزل المكورات العقدية اسيدومينيموس، Aerococcus viridans تخثر المكورات العنقودية السلبية وE.coli من C57 الأسود ستة N الفئران.عند محاولة هذا البروتوكول، نضع في اعتبارنا أن أفضل نتيجة سوف تتحقق عن طريق طلاء مسحة رقيقة وأخذ الوقت خلال خطوة مسحة العين. إذا كان الوصول إلى مرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF محدودا، فيمكن تحديد العزلات عن طريق الاختبارات الميكروبيولوجية والكيميائية الحيوية.

conjunctival-commensal-isolation-and-identification-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

تحديد وعزل أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من نخاع العظام الماوس

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.

عزل وتحديد الخلايا المناعية اكسترافاسكولار للقلب

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

نموذج الإدارة عن طريق الفم Galleria mellonella للاستجابات المناعية الفطرية Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.