Name: conjunctival commensal isolation and identification in mice
Uploaded: 2021-05-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice at JoVE.com

Die Finanzierung von P30 DK034854 unterstützte VY, LB und Studien im Massachusetts Host-Microbiome Center und die Finanzierung von NIH / NEI R01 EY022054 unterstützte MG.

Alle Verfahren mit Mäusen folgen den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee. Befolgen Sie die Laborsicherheitsrichtlinien (gemäß den Anweisungen Ihrer Abteilung für umweltbedingte Gesundheit und Sicherheit), wenn Sie mit Mikroorganismen und potenziell kontaminierten Materialien arbeiten. Verwenden Sie geeignete Abfallbehälter und Dekontaminationsverfahren, bevor Sie potenziell biologisch kontaminationsgefährdete Materialien entsorgen.
1. Vorbereitung des Augenabstrichs...

<ol>
	<li>Arpaia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+produced+by+commensal+bacteria+promote+peripheral+regulatory+T+cell+generation.">Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation.</a> Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).</li><li>Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+microbiota+and+the+immune+system.">Interactions between the microbiota and the immune system.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-origin+probiotic+cocktail+increases+short+chain+fatty+acid+production+via+modulation+of+mice+and+human+gut+microbiome.">Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).</li><li>Graham, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+pathogen+or+commensal:+a+PCR+based+study+of+surface+bacterial+flora+in+normal+and+dry+eyes.">Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren-Like+Lacrimal+Keratoconjunctivitis+in+Germ-Free+Mice.">Sj&#246;gren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).</li><li>Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+ocular+microbial+communities+in+diabetic+patients+compared+with+healthy+subjects.">Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects.</a> Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).</li><li>Doan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paucibacterial+microbiome+and+resident+DNA+virome+of+the+healthy+conjunctiva.">Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).</li><li>Kugadas, A., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+microbiome+on+ocular+health.">Impact of microbiome on ocular health.</a> Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).</li><li>Dong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+bacteria+at+healthy+human+conjunctiva.">Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).</li><li>Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+understanding+the+ocular+surface+microbiome.">Considerations in understanding the ocular surface microbiome.</a> American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).</li><li>Fleiszig, S. M., Efron, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+flora+in+eyes+of+current+and+former+contact+lens+wearers.">Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers.</a> Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+L-Plastin+Controls+Ocular+Paucibacteriality+and+Susceptibility+to+Keratitis.">Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).</li><li>Johnson, T. R., Case, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).</li><li>Reiner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalase+Test+Protocol.">Catalase Test Protocol.</a> American Society for Microbiology. , (2010).</li><li>UK SMI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).</li><li>Sharp, S. E., Searcy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mannitol+salt+agar+and+blood+agar+plates+for+identification+and+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus+in+specimens+from+cystic+fibrosis+patients.">Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).</li><li>Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milleri+group+streptococcus--a+stepchild+in+the+viridans+family.">Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family.</a> European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).</li><li>Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerococcus+Viridans:+A+Rare+Pathogen+Causing+Urinary+Tract+Infection.">Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).</li><li>Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+is+a+sensitive+and+specific+method+for+identification+of+aerococci.">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).</li><li>Wan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1R+and+MyD88+contribute+to+the+absence+of+a+bacterial+microbiome+on+the+healthy+murine+cornea.">IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).</li><li>Ozkan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Stability+and+Composition+of+the+Ocular+Surface+Microbiome.">Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).</li><li>Oliver, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viable+but+non-culturable+state+in+bacteria.">The viable but non-culturable state in bacteria.</a> Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).</li><li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenomenon+of+microbial+uncultivability.">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).</li><li>Whelan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-enriched+metagenomic+sequencing+enables+in-depth+profiling+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiota.">Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota.</a> Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).</li><li>Raymond, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-enriched+human+gut+microbiomes+reveal+core+and+accessory+resistance+genes.">Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes.</a> Microbiome. 7, 56 (2019).</li><li>Peto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+enrichment+and+sequencing+of+feces+to+enhance+detection+of+antimicrobial+resistance+genes+in+third-generation+cephalosporin+resistant+Enterobacteriaceae.">Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae.</a> PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).</li><li>Lauer, B. A., Masters, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effect+of+calcium+alginate+swabs+on+Neisseria+gonorrhoeae.">Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).</li><li>Dubois, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+the+Vitek+MS+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+system+for+rapid+identification+of+bacteria+in+routine+clinical+microbiology.">Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).</li><li>Kawakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=double-blind+study+of+the+safety+and+Efficacy+of+1%D-3-Hydroxybutyrate+eye+drops+for+Dry+Eye+Disease.">double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease.</a> Scientific Reports. 6, 20855 (2016).</li><li>Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+toll-like+receptor+4+contributes+to+corneal+inflammation+in+experimental+dry+eye+disease.">Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).</li><li>Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+to+lipopolysaccharide+on+the+ocular+surface+in+a+murine+dry+eye+model.">Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).</li><li>Miller, D., Ioviano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microbial+flora+on+the+ocular+surface.">The role of microbial flora on the ocular surface.</a> Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).</li><li>Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+epigenetic+changes+caused+by+commensal+microbiota+contribute+to+development+of+ocular+disease?+A+review+of+evidence.">Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence.</a> Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).</li><li>Stevenson, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+disease:+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder.">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).</li></ol>

Aufgrund des paucibakteriellen Zustands der Augenoberfläche hatten viele Labore Schwierigkeiten, die okulären Kommensalen7,20zuisolieren, was zu einer geringen Anzahl von Proben mit Wachstum, geringer Häufigkeit und geringer Diversitätführte 8. Diese Methode verbessert die Standardkulturpraktiken4,21 erheblich durch die Hinzufügung eines Anreicherungsschritts sowie eines neu ...

Ziel dieses Protokolls ist es, die spezifische Isolierung lebensfähiger und seltener aerober und fakultativer anaerober Mikroben aus der okulären Bindehaut zu verbessern, um das okuläre Mikrobiom zu charakterisieren. Umfangreiche Studien haben kommensale Schleimhautgemeinschaften auf Haut, Darm, Atemwegen und Genitaltrakt profiliert und zeigen, dass diese Gemeinschaften die Entwicklung des Immunsystems und die Reaktion beeinflussen1,2,3. Es wurde gezeigt, dass sich okuläre Kommensalgemeinschaften während bestimmter Krankheitspathologien wie der Erkrankung des trockenen Auges4, des Sjögren-Syndroms5 und des Diabetes6verändern. Die Fähigkeit, eine typische kommensale Gemeinschaft an der Augenoberfläche zu definieren, wird jedoch durch ihre relativ geringe Häufigkeit im Vergleich zu den anderenSchleimhautstellen behindert 6,7,8. Dies löst eine Kontroverse darüber aus, ob es ein residentes Augenmikrobiom gibt und ob es existiert, ob es sich vom Hautmikrobiom und folglich seiner lokalen Wirkung auf die Entwicklung und Reaktion des angeborenen Immunsystems unterscheidet. Dieses Protokoll kann helfen, diese Frage zu lösen.
Im Allgemeinen basieren Ansätze zur Definition der okulären kommensalen Nische auf Sequenzierung und kulturbasierten Techniken4,7,9. 16 S rDNA-Sequenzierung und BRISK-Analyse7 zeigen eine größere Vielfalt als kulturbasierte Techniken, sind aber nicht in der Lage, zwischen lebenden und toten Mikroben zu unterscheiden. Da die Augenoberfläche für viele Mikroben aufgrund der antimikrobiellen Eigenschaften des Tränenfilms 4 feindlichist, die eine große Anzahl von DNA-Fragmenten erzeugen, werden DNA-basierte Ansätze diese Artefakte erkennen, die die Daten zur Identifizierung toter Bakterien als ansässige Kommensale und nicht als Verunreinigungen verzerren können. Dies führt zu einer abweichenden kommensalen Identifizierung und Charakterisierung des Augenraums als höher in Mikrobenhäufigkeit und Diversität10. Dies macht es schwierig, das ansässige okuläre Mikrobiom mit DNA-basierten Methoden zu definieren. Während Standardkulturbasierte Techniken keine Kommensalen erkennen können, weil die Last zu niedrig ist11. Unsere Methode verbessert die Standardpraktiken, indem sie einen dünnen Tupfer verwendet, der auf die Bindehaut abzielen kann, wodurch eine Kontamination durch benachbarte Haut vermieden wird, sowie das Konzept, dass lebensfähige Organismen durch kurze Kultur in nährstoffreichen Medien angereichert werden können, mit dem Ziel, lebensfähige, aber nicht kultivierbare, sowie die Anreicherung seltener lebensfähiger Mikroben wiederzubeleben.
Die Ergebnisse, relative Häufigkeit von okulären Kommensalen pro Augenabstrich, charakterisieren das Bindehaut-residente Mikrobiom und sind für Vergleichszwecke wichtig. Unsere Daten zeigen, dass es einen Unterschied zwischen Haut und Bindehautmikrobiota sowie eine größere Vielfalt mit zunehmendem Alter und einem geschlechtsspezifischen Unterschied in der Fülle gibt. Darüber hinaus hat dieser Ansatz reproduzierbar kommsale Unterschiede bei Knock-out-Mäusengefunden 12. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um das okuläre Mikrobiom zu beschreiben, das aufgrund von Käfigpraktiken, Geografie oder Krankheitszustand variieren kann, sowie die lokalen Auswirkungen von kommensalen Metaboliten und Produkten auf die Entwicklung und Reaktion des Immunsystems.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 to 10 &#181;l pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1110-300</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 to 10 &#181;l Eppendorf pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD309623</td>
			<td>1 syringe for each eye swab group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181; ml pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2021</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 to 1000&#181;l Gilson pipetman (P1000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>1 needle per eye swab group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 % Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176; C Incubator</td>
			<td>Lab equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 % Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PX1840-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)</td>
			<td>Santa Cruz Animal Health</td>
			<td>SC-362949Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BBL Gram Stain kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Lab equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean paper towels</td>
			<td>Lab equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Batting/Sterile rolled cotton</td>
			<td>CVS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1 ml Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>for Gram stain and catalase tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>ATCC 8739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>for Gram stain and catalase tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (100mg/ml)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9950001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey Agar Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4321270</td>
			<td>store at 4 &#176;C until ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol Salt Agar</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>784641</td>
			<td>Prepare plates according to mfr&#39;s instructions, store at 4 &#176;C for 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57/BL6J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
			<td>for Mannitol Salt agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPI Brain Heart Infusion Media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-488525</td>
			<td>prepare according to directions and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteriFlip (0.22 &#181;m pore size polyester sulfone)</td>
			<td>EMD/Millipore, Fisher Scientifc</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>to sterilize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>anesthesia preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile mouse cage</td>
			<td>Lab equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth picks (round bamboo)</td>
			<td>Kitchen Essentials</td>
			<td></td>
			<td>autoclave before use and swab preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep&#39;s Blood Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4321261</td>
			<td>store at 4 &#176;C until ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitek target slide</td>
			<td>BioMerieux Inc. Durham,NC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitek-MS</td>
			<td>BioMerieux Inc. Durham,NC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitek-MS CHCA matrix solution</td>
			<td>BioMerieux Inc. Durham, NC</td>
			<td>411071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single use eye drops</td>
			<td>CVS Pharmacy</td>
			<td></td>
			<td>Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conjunctival commensal isolation and identification in mice

Die Augenoberfläche galt einst als immunprivilegiert und abiotisch, aber in letzter Zeit scheint es, dass es eine kleine, aber anhaltende kommensale Präsenz gibt. Die Identifizierung und Überwachung von Bakterienarten an der Augenschleimhaut war aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und der begrenzten Verfügbarkeit geeigneter Methoden für das kommensale Wachstum und die Identifizierung eine Herausforderung. Es gibt zwei Standardansätze: kulturbasierte oder DNA-Sequenzierungsmethoden. Die erste Methode ist aufgrund der begrenzten rückgewinnbaren Bakterien problematisch und der zweite Ansatz identifiziert sowohl lebende als auch tote Bakterien, was zu einer abweichenden Darstellung des Augenraums führt. Wir haben eine robuste und empfindliche Methode zur Bakterienisolierung entwickelt, indem wir auf mikrobiologischen Standardkulturtechniken aufbauen. Dies ist eine auf Tupfern basierende Technik, bei der ein "im Labor" hergestellter dünner Tupfer verwendet wird, der auf die untere Bindehaut abzielt, gefolgt von einem Amplifikationsschritt für aerobe und fakultative anaerobe Gattungen. Dieses Protokoll hat es uns ermöglicht, Bindehautarten wie Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. usw.zu isolieren und zu identifizieren. Der Ansatz eignet sich, um die kommmensale Diversität bei Mäusen unter verschiedenen Krankheitsbedingungen zu definieren.

Repräsentative Ergebnisse für eine Augenabstrichplatte, die verschiedene Methoden zur Beschichtung demonstriert, sind in Abbildung 3A dargestellt, die morphologisch unterschiedliche Isolate von C57BL/6-Maus zeigt. Für jedes einzelne Isolat wurden die Kolonien im Streifen gezählt und die relative Häufigkeit, einzigartige Colony Forming Units (CFUs) pro Augenabstrich, berechnet und zu Vergleichszwecken aufgezeichnet. Für die mikrobiologische Charakterisierung wurden Bakterien aus einzeln...

Watch this Scientific Journal Video about Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice at JoVE.com

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Amplifikation aerober und fakultativer anaerober Maus-Bindehaut-Kommensalbakterien unter Verwendung eines einzigartigen Augenabstrichs und eines kulturbasierten Anreicherungsschritts mit anschließender Identifizierung durch mikrobiologische Methoden und MALDI-TOF-Massenspektrometrie vorgestellt.

Bindehautkommusale Isolierung und Identifizierung bei Mäusen

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Diese Methode identifiziert lebensfähige okuläre Bindehautmikroorganismen, was aufgrund der feindlichen Umgebung der Augen eine Herausforderung darstellt. Es kann helfen zu beantworten, ob ein okuläres Mikrobiom existiert und wie sich die bakterielle Präsenz bei Augenerkrankungen verändert. Im Gegensatz zur DNA-Sequenzierung, die sowohl lebensfähige als auch nicht lebensfähige Mikroorganismen identifiziert, identifiziert diese Methode nur lebensfähige Mikroorganismen, was zu einem klareren Verständnis der okulären Kommensalgemeinschaft führt.Studien deuten darauf hin, dass schwer zu diagnostizierende Augenkrankheiten wie nicht-autoimmunes und autoimmunes trockenes Auge eine einzigartige okuläre bakterielle Präsenz haben. Diese Methode könnte verwendet werden, um Augenkrankheiten mit ausgeprägten mikrobiellen Signaturen zu diagnostizieren. Beginnen Sie mit dem Autoklavieren der entsprechenden Menge an Baumwollschlägern und Zahnstochern für die Anzahl der Mäuse, die abgetupft werden sollen, dann kneifen Sie 1/2 Zentimeter langes Stück Baumwollschläger ab und necken Sie es heraus, indem Sie an den Rändern ziehen, um eine flache einzelne poröse Schicht zu bilden, die kurz vor dem Auseinanderfallen des Schlages stoppt.Schwenken Sie den Schlag um eines der scharfen Enden des Zahnstochers, indem Sie das ausgestreckte Stück leicht an der Zahnstocherspitze halten, während es verdreht wird. Der fertige Augenabstrich wird eine sehr dünne Schicht Baumwolle haben, die über die Spitze gespannt ist und sich etwa 1/2 bis einen Zentimeter von der Spitze entfernt erstreckt. Die Tupfer in ein kleines Becherglas geben, mit der Seite nach unten abtupfen, dann abdecken und autoklavieren.Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit einem Desinfektionsmittel, um die Kontamination zu minimieren, und aliquotieren Sie 0,5 Milliliter sterile Gehirnherzinfusion oder BHI-Medien in markierte 1,5 Milliliter sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die Rohre in einem Rack und stellen Sie das Rack auf Eis. Richten Sie den Workflow von links nach rechts ein, beginnend mit der Mausanästhesiestation, die den Käfig mit den Versuchsmäusen, den leeren sterilen Käfig, die Anästhesie bei Raumtemperatur, die 25-Gauge-Nadel und eine Ein-Milliliter-Spritze enthält.Als nächstes bereiten Sie eine Augenabstrichstation vor, die das aliquotierte BHI auf Eis, sterilisierte Augenabstriche, schmierende Augentropfen, Biogefahrenbehälter, saubere Papierhandtücher und 70% Isopropanol-Spray enthält. Schließlich richten Sie die Beschichtungsstation mit Blutagarplatten bei Raumtemperatur, einer 10-Mikroliter-Pipette, 10-Mikroliter-Steriler-Einwegspitzen und einem Biohazard-Abfallbehälter ein. Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig betäubt ist, indem Sie ein Fußpolster der Hinterhand zusammendrücken.Fahren Sie nur fort, wenn keine Bewegung vorhanden ist. Weisen Sie eine Hand zu, um anästhesierte Mäuse zu behandeln, und die anderen Hände, um den Augenabstrich und die Kultur zu handhaben. Nehmen Sie die Maus aus dem Käfig und legen Sie sie auf die Arbeitsfläche, die auf der Seite positioniert ist, wobei das linke Auge freigelegt ist.Besprühen Sie die behandschuhten Hände mit Isopropanol und trocknen Sie sie mit einem Papiertuch. Entkappen Sie das beschriftete BHI-Mikrozentrifugenrohr mit der speziellen Medienhandhand und legen Sie die beiden wieder in das Rack. Tauchen Sie die mit Baumwolle beschichtete Spitze des Augentupfers in den BHI, ziehen Sie dann den Tupfer aus dem Röhrchen, während Sie die Spitze zweimal gegen das Innenrohr schwenken, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und zu entfernen.Halten Sie die Maus mit der Hand vorsichtig am Hals. Mit der anderen Hand die Spitze des Augenabstrichs gegen die mediale Bindehautregion des linken Auges legen. Drücken Sie den Augapfel leicht und bewegen Sie den Tupfer in einer Fensterwaschbewegung zwischen dem unteren Augenlid und dem Auge 10 Mal, wobei der Druck konstant bleibt.Ohne das Fell zu berühren, entfernen Sie vorsichtig die Spitze des Tupfers senkrecht zu der Stelle, an der er eingeführt wurde. Legen Sie den Tupfer mit der Baumwollseite nach unten, direkt in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen mit BHI-Medien. Tragen Sie einen Augentropfen auf das abgetupfte Auge auf.Falls gewünscht, erwerben Sie Haut- oder Felltupfer für Kontrollproben und sterilisieren Sie Handschuhe entsprechend zwischen jedem Tupfer. Wenn Sie fertig sind, bringen Sie die Maus in den Käfig zurück. Lassen Sie den Tupfer 10 bis 15 Minuten auf Eis stehen, sterilisieren Sie dann die behandschuhten Hände und entfernen Sie den Tupfer, während Sie die Spitze für 10 Umdrehungen im Medium mischen.Ziehen Sie den Tupfer zurück, indem Sie die Spitze für fünf Umdrehungen gegen die Innenwand des Rohrs schwenken und in einem biogefährlichen Behälter entsorgen. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Maus. Reichern Sie die Probe an, indem Sie das Röhrchen statisch für eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren.Beschriften Sie während der Inkubation eine TSA-Platte bei Raumtemperatur pro Mausaugenabstrich oder Kontrolltupfer und teilen Sie sie in zwei Hälften. Entfernen Sie die angereicherten Proben aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Die zu mischende Probe kurz vortexen, dann 10 Mikroliter der Probe auf die TSA-Platte aliquoten und die Platte kippen, um einen Streifen zu bilden.Wiederholen Sie dies zweimal. Erstellen Sie auf der anderen Seite der Plattentrennlinie 10 Punkte mit jeweils 10 Mikrolitern Probe. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 18 Stunden, zwei Tage und vier Tage in einer sauberen Kammer, die das Austrocknen der Agarplatten verhindert.Zählen Sie die Kolonien in den Streifen. Beachten Sie die Morphologie und berechnen Sie koloniebildende Einheiten pro Tupfer für morphologisch ähnliche Isolate. Schauen Sie sich die Punkte an, an denen einzigartige Organismen nicht in den Streifen gefangen sind.Um die Visualisierung zu erleichtern, haben wir Bakterien dicht in der mittleren und rechten Platte plattiert. Typischerweise beobachteten wir viel weniger Bakterien in Augenabstrichplatten. Beachten Sie, dass die Augenabstriche gelegentlich keine rückgewinnbaren Bakterien ergeben.Eine repräsentative Augenabstrichplatte mit morphologisch vielfältigen Isolaten einer C57 Black Six Maus ist hier zu sehen. Für jedes einzelne Isolat wurden die Kolonien im Streifen gezählt und die relative Häufigkeit berechnet und aufgezeichnet. Für die mikrobiologische Charakterisierung wurden Bakterien aus einzelnen Mausaugenabstrichplatten ausgewählt, um eine Master-TSA-Platte zu erzeugen.Als das Wachstum auftrat, wurden zusätzliche Tests durchgeführt, um die Mikroben zu charakterisieren oder zu identifizieren. Die Masterplatte wurde verwendet, um genügend Inokum bereitzustellen, um die jeweiligen Isolate zu erweitern. Um Isolate zu identifizieren, wurde eine TSA-Platte über Nacht gestreift und inkubiert und MALDI-TOF MS durchgeführt.Beispiele für die hier gezeigten Isolate wurden als Streptococcus acidominimus und Aerococcus viridans identifiziert. Signifikant unterschiedliche Konzentrationen von kommensalen Organismen wurden von männlichen und weiblichen C57 schwarzen sechs Mäusen gewonnen. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans koaguliert negative Staphylokokken und E.coli wurden aus C57 schwarzen sechs N Mäusen isoliert.Denken Sie beim Versuch dieses Protokolls daran, dass das beste Ergebnis erzielt wird, indem Sie den Tupfer dünn beschichten und sich während des Augenabstrichs Zeit nehmen. Wenn der Zugang zu MALDI-TOF MS begrenzt ist, können die Isolate durch mikrobiologische und biochemische Tests identifiziert werden.

conjunctival-commensal-isolation-and-identification-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.

Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.