Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Forfatteren vil gerne takke Steve Siegelbaum for støtte. Finansieringen ydes af 5R01NS106983-02 samt 1 F31 NS113466-01.

Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Forbered løsninger
<ol><li>Der fremstilles en saccharoseskæreopløsning til udskæring som beskrevet i tabel 1. BEMÆRK: Efter tilberedning af 1 L saccharoseopløsning fryses en lille mængde (ca. 100-200 ml) i en isbakke. Disse frosne saccharoseisninger vil blive blandet ind i en iskold gylle (se trin 4.3).<...

Der er flere trin i denne udskæringsprotokol designet til at fremme vævssundheden og favorisere fremkomsten af spontan naturalistisk netværksaktivitet: musen er transcardialt perfunderet med kølet saccharoseskæringsopløsning; vandret-entorhinal cortex (HEC) skiver skæres i en tykkelse på 450 μm fra den mellemliggende eller ventral hippocampus; skiver inddrive på grænsefladen af opvarmet ACSF og befugtet, carbogen-rige luft; under optagelser superfunderes skiver med ACSF opvarmet til 32 °C og leveres med en hu...

Elektrofysiologiske målinger fra levende hippocampale skiver in vitro er en kraftfuld eksperimentel tilgang med mange fordele. Eksperimentatoren kan bruge et mikroskop, mikromanipulatorer og et optagelsessystem til direkte at visualisere og indsamle målinger fra individuelle neuroner i vævet. Vævsskiver er også meget tilgængelige for fototimulation eller lægemiddellevering til optogenetiske, kemogenetiske eller farmakologiske eksperimenter.
Hippocampal-netværket genererer meget synkron befolkningsaktivitet in vivo, synlig som svingninger i det ekstracellulære lokale feltpotentiale1,2,3,4,5. Brain slice metoder er blevet udnyttet til at få indsigt i de cellulære og kredsløb mekanismer, der ligger til grund for disse neuronale netværk svingninger. Foundational arbejde fra Maier et al. viste, at skarpe bølge-krusning komplekser (SWRs) kan opstå spontant i skiver af ventral hippocampus6,7. Efterfølgende undersøgelser fra flere efterforskere har gradvist belyst mange aspekter af stålwirer, herunder neuromodulatorernes rolle i reguleringen af hippocampus 8 ,9,10 og de synaptiske mekanismer, der driver in vitro-reaktivering af neuronale ensembler, der tidligere var aktive under adfærd in vivo11. Brain slice eksperimenter har også givet indsigt i gamma rækkevidde svingning (30-100 Hz), en særskilt hippocampal netværk tilstand menes at støtte hukommelse kodning og huske12,13. Endelig anerkender den centrale rolle hippocampus og tilknyttede strukturer i patofysiologien af temporal lobe epilepsi14,15, forskere har brugt hippocampale skivepræparater til at undersøge generering og formering af epileptiform aktivitet. Carter et al. påviste, at kombinerede hippocampal-entorhinal cortex skiver fremstillet af kronisk epileptiske dyr spontant kan generere epileptiform udledninger in vitro16. Efterfølgende undersøgte Karlócai et al. de mekanismer, der ligger til grund for epileptiformudladninger i hippocampale skiver ved hjælp af modificeret kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med ændrede ionkoncentrationer (reduceret Mg2+ eller forhøjet K+) eller tilsat stoffer (4AP eller gabazin)17.
Efterforskere har udviklet adskillige hippocampale skive tilgange, der adskiller sig på centrale måder: (1) regionen hippocampus indeholdt i skiven (dorsal, mellemliggende eller ventral); 2) tilstedeværelsen eller fraværet af ekstrahippocampal væv såsom entorhinal cortex; (3) den orientering, der anvendes til at skære skiver (koronar, sagittal, vandret eller skrå) og (4) de forhold, hvorunder vævet holdes efter udskæring (nedsænket fuldt ud i ACSF eller holdes ved grænsefladen mellem ACSF og befugtet, carbogen-rig luft).
Valget af, hvilken udskæringsmetode der skal anvendes, bør bestemmes af forsøgsmålsætningen. For eksempel, tværgående eller koronar skiver af dorsale hippocampus opretholdes under neddykkede forhold er blevet brugt meget effektivt til undersøgelse af intrahippocampal kredsløb og synaptisk plasticitet18,19,20. Sådanne præparater genererer dog ikke spontant netværkssvingninger så let som skiver fra ventral hippocampus21,22,23. Selv om en tilstand af vedvarende SWR-aktivitet kan fremkaldes ved stivkrampe stimulation i tværgående skiver fra den dorsale og ventrale hippocampus24, observeres spontane stålwirer lettere i ventralskiver7,25.
En iboende fysiologisk og anatomisk skelnen mellem den dorsale og ventral hippocampus understøttes af undersøgelser udført både in vivo og in vitro26. Optagelser i rotter afslørede stærkt sammenhængende theta rytmer i hele dorsale og mellemliggende hippocampus, men dårlig sammenhæng mellem ventral regionen og resten af hippocampus27. Stålwirer in vivo formerer sig let mellem den dorsale og mellemliggende hippocampus, mens stålwirer, der stammer fra den ventrale hippocampus, ofte forbliver lokale28. De foreningsmæssige fremskrivninger stammer fra CA3 pyramide neuroner, der bor i den dorsale og mellemliggende hippocampus projekt lange afstande langs langs langsgående akse hippocampus. CA3-fremskrivninger fra ventrale regioner er fortsat relativt lokale og er derfor mindre tilbøjelige til at blive afbrudt under udskæringsprocessen29,30. Ventralskiver kan derfor bedre bevare det tilbagevendende netværk, der er nødvendigt for at generere befolkningssynkronisering. Tilbøjeligheden af ventrale skiver til at generere spontane netværksaktiviteter in vitro kan også afspejle højere iboende excitabilitet af pyramide neuroner eller svagere GABAergic hæmning i ventral hippocampus i forhold til mere dorsale regioner31. Faktisk ventral hippocampal skiver er mere modtagelige for epileptiform aktivitet32,33. Således har mange undersøgelser af spontane fysiologiske8,9,11,24 eller patologiske16,34,35,36 netværkssvingninger traditionelt brugt en vandret udskæringsmetode, nogle gange med en lille vinkel i fronto-occipital retning, som giver vævsskiver parallelt med det tværgående plan af ventral hippocampus.
Netværksforbindelsen påvirkes uundgåeligt af udskæringsproceduren, da mange celler i skiven vil blive afbrudt. Vinklen og tykkelsen af skiven og vævet, der tilbageholdes i præparatet, bør overvejes for at optimere forbindelsen i de kredsløb, der er af interesse. Mange undersøgelser har udnyttet horisontale kombinerede hippocampal-entorhinal cortex skiver (HEC) til at udforske interaktioner mellem de to strukturer i forbindelse med fysiologiske eller patologiske netværk svingninger. Roth et al. udførte dobbelte optagelser fra CA1-underfeltet i hippocampus og lag V i den mediale entorhinale cortex for at demonstrere udbredelse af SWR-aktivitet gennem HEC-skiven37. Mange undersøgelser af epileptiform aktivitet har brugt HEC skive forberedelse til at undersøge, hvordan epileptiform udledninger formere sig gennem corticohippocampal netværk16,35,36,38. Det er vigtigt at bemærke, at bevarelse af den intakte kortikohippocampal sløjfe ikke er en forudsætning for spontane stålwirer, epileptiformudladninger eller gammasvingninger; netværk svingninger kan genereres i tværgående skiver af dorsale eller ventral hippocampus uden vedlagte parahippocampal væv21,22,23, 25,39,40,41. En vigtigere faktor for den spontane generering af netværkssvingninger i hippocampale skiver kan være tykkelsen af hver skive, da en tykkere skive (400-550 μm) vil bevare mere forbindelse i CA2/CA3 tilbagevendende netværk21,22,25.
Selv om vinklede vandrette HEC-skiver (skåret med en ca. 12° vinkel i fronto-occipital retning) er blevet brugt til at studere den funktionelle forbindelse mellem kortikohippocampal loop11,16,34,35,42, er sådanne vinklede præparater ikke nødvendige for spontan netværksaktivitet43,44,45. Brugen af et vinklet udskæringsplan gør det dog muligt for investigator selektivt at lave skiver, der bedst bevarer den tværgående orienterede lameller af enten ventral eller mellemliggende hippocampus, afhængigt af om der anvendes en nedadgående eller en opadgående vinkel (Figur 1). Denne tilgang er begrebsmæssigt svarer til den, der anvendes af Papatheodoropoulos et al., 2002, der dissekeret hver hippocampus fri og derefter brugt en væv chopper til at skabe tværgående skiver langs hele dorsal-ventral akse21. I lyset af ovennævnte funktionelle sondringer mellem den ventrale og dorsale mellemliggende hippocampus bør efterforskerne overveje skivernes anatomiske oprindelse, når de udformer eksperimenter eller fortolker resultater. Brug af en agar rampe under udskæringsproceduren er en enkel måde at fortrinsvis producere skiver fra enten den mellemliggende eller ventral hippocampus.
Hippocampal skiver kan opretholdes i enten en nedsænket kammer (med vævet fuldt nedsænket i ACSF), eller en grænseflade-stil kammer (f.eks Oslo eller Haas kammer, med skiver, der kun er omfattet af en tynd film af flydende medier). Interface vedligeholdelse øger iltning af vævet, som fremmer neuronal overlevelse og giver mulighed for vedvarende høje niveauer af internuronal aktivitet. Traditionelt bruger neddykkede optagelsesforhold en langsommere ACSF-strømningshastighed, der ikke giver tilstrækkelig iltning af væv til stabilt udtryk for svingninger på netværksniveau. I neddykkede hippocampale skiver observeres carbachol-inducerede gammasvingninger kun forbigående46,47, mens de kan holdes stabilt i grænsefladeregistreringskamre10,48,49. Som sådan har mange undersøgelser af komplekse spontane aktivitet in vitro påberåbt grænseflade registrering kamre til at undersøge skarpe bølge krusning komplekser6,7,8,9,10,25,37, gamma svingninger10,13, og epileptiform aktivitet16,38,45,47.
I et indspilningskammer i neddykket stil kan et mål for nedsænkningsmikroskop bruges til at visualisere individuelle celler og selektivt målrette sunde celler mod optagelser. Det nedsænkede præparat giver også fin kontrol over det cellulære miljø, da nedsænkning letter hurtig spredning af stoffer eller andre forbindelser til vævet. En ændret metode, hvor stabile netsvingninger opretholdes under neddykkede forhold, repræsenterer således en stærk eksperimentel tilgang. Denne fremgangsmåde er eksemplificeret ved arbejdet i Hájos et al., hvor hippocampal skiver inddrive i en forenklet interface-stil bedrift kammer i flere timer før overførsel til en modificeret nedsænket optagelse kammer med en høj strømningshastighed af ACSF (~ 6 mL/ min) for at øge iltforsyningen til vævet12,48,49. Under disse omstændigheder kan høje niveauer af internuronaktivitet og stabile spontane netværkssvingninger opretholdes i et neddykket optagelseskammer. Denne ændrede tilgang gør det muligt for efterforskerne at udføre visuelt styrede helcelleplasterklemmeoptagelser og karakterisere bidraget fra morfologisk identificerede celletyper til carbachol-inducerede gammasvingninger12. Stålwirer kan også forekomme spontant i neddykkede hippocampale skiver med en hurtig strømningshastighed på ACSF11,48,49. Maier et al. påviste, at hippocampale skiver, der kom sig i et grænsefladekammer før overførsel til et nedsænket optagelseskammer pålideligt, udstillede spontane stålwirer, mens skiver, der kom sig nedsænket i et bægerglas før overførsel til et nedsænket optagelseskammer, viste mindre fremkaldte feltresponser, lavere niveauer af spontane synaptiske strømme og kun meget sjældent udstillede spontaneSWR'er 43. Schlingloff et al. anvendte denne forbedrede metode til at demonstrere parvalbumin-udtrykkende kurvcellers rolle i generering af spontane stålwirer44.
Følgende protokol præsenterer en udskæringsmetode, hvorigennem spontant aktive neuroner i vandrette hippocampale skiver kan genvindes under grænsefladeforhold og efterfølgende opretholdes i et nedsænket optagelseskammer, der er egnet til farmakologiske eller optogenetiske manipulationer og visuelt styrede optagelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

Akut gnaver hjerne udskæring tilbyder en tractable eksperimentel tilgang til at få indsigt i organiseringen og funktionen af neurale kredsløb med enkelt-celle opløsning ved hjælp af elektrofysiologi, mikroskopi, og farmakologi. En vigtig overvejelse i udformningen af in vitro-eksperimenter er imidlertid, i hvilket omfang forskellige skivepræparater sammenfatter naturalistiske mønstre af neural aktivitet som observeret in vivo. I den intakte hjerne genererer hippocampalnetværket stærkt synkroniseret befolkningsaktivitet, der afspejler dyrets adfærdsmæssige tilstand, som eksemplificeret ved de skarpe bølge krusningskomplekser (SWR'er), der opstår under vågne fuldbyrdelsestilstande eller ikke-REM-søvn. Stålwirer og andre former for netværksaktivitet kan opstå spontant i isolerede hippocampale skiver under passende forhold. For at anvende den kraftfulde hjerneskiveværktøjssæt til undersøgelse af hippocampal netværksaktivitet er det nødvendigt at bruge en tilgang, der optimerer vævssundheden og bevarelsen af funktionel forbindelse inden for hippocampalnetværket. Mus er transcardially perfunderes med kold saccharose-baserede kunstige cerebrospinalvæske. Vandrette skiver, der indeholder hippocampus, skæres i en tykkelse på 450 μm for at bevare synaptisk forbindelse. Skiver inddrive i en grænseflade-stil kammer og overføres til en nedsænket kammer til optagelser. Optagelseskammeret er designet til dobbelt overflade superfusion af kunstig cerebrospinalvæske ved en høj strømningshastighed for at forbedre iltningen af skiven. Denne protokol giver sundt væv egnet til undersøgelse af komplekse og spontane netværk aktivitet in vitro.

Præsenteret her er repræsentative optagelser fra HEC skiver udarbejdet som beskrevet i denne protokol. Efter genvinding i et grænsefladeholdekammer (figur 1C) overføres skiver individuelt til et neddykket optagelseskammer (Figur 2B). Optagelseskammeret forsynes med carbogenmættet ACSF ved hjælp af en peristaltisk pumpe (Figur 2A). Pumpen trækker først ACSF fra et holdeglas ind i et opvarmet reservoir. Carbogen linjer er plac...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Denne protokol beskriver forberedelsen af vandrette hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver fra mus, der udviser spontan skarpbølge krusningsaktivitet. Skiver inkuberes i et forenklet grænsefladeholderkammer, og optagelser udføres under neddykkede forhold med hurtigtflydende kunstig cerebrospinalvæske for at fremme iltning af væv og spontan fremkomst af aktivitet på netværksniveau.

Akut Musehjerne udskæring for at undersøge spontan hippocampal netværksaktivitet

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bestemmelse af Spontan motorisk aktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akut voksne hjerne Slicing i fysiologisk temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Immunhistokemisk Visualisering af Hippocampal Neuron aktivitet efter Spatial Læring i en musemodel af forstyrrelser i nervesystemets udvikling

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induktion af en Isoelectric Brain State til at undersøge betydningen af ​​endogene Synaptic aktivitet på neuronexcitabilitet<em&gt; In vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluering af Synapse tæthed i hippocampus gnaver hjernen skiver

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En præklinisk model til vurdering af hjerne bedring efter akut slagtilfælde hos rotter

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Forberedelse af akut humane hippocampale skiver til elektrofysiologiske optagelser

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...