Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

De auteur wil Steve Siegelbaum bedanken voor zijn steun. Financiering wordt verstrekt door 5R01NS106983-02 en 1 F31 NS113466-01.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Bereid oplossingen voor
<ol><li>Bereid sacharosesnijoplossing voor het snijden zoals beschreven in tabel 1. OPMERKING: Vries na het bereiden van 1 L sacharoseoplossing een kleine hoeveelheid (ongeveer 100-200 ml) in in een ijslade. Deze bevroren sacharose ijsblokjes worden gemengd tot een ijzige slurry (zie stap 4.3)...

Er zijn verschillende stappen in dit snijprotocol dat is ontworpen om de gezondheid van weefsels te bevorderen en de opkomst van spontane naturalistische netwerkactiviteit te bevorderen: de muis is transcardieel doordrenkt met gekoelde sacharose-snijoplossing; horizontaal-entorhinale cortex (HEC) plakjes worden gesneden op een dikte van 450 μm van de tussenliggende of ventrale hippocampus; plakjes herstellen zich op het raakvlak van verwarmde ACSF en bevochtigde, carbogenrijke lucht; tijdens opnames worden plakjes met A...

Elektrofysiologische meting van levende hippocampale plakjes in vitro is een krachtige experimentele aanpak met tal van voordelen. De experimenteerder kan een microscoop, micromanipulatoren en een opnamesysteem gebruiken om metingen van individuele neuronen in het weefsel direct te visualiseren en te verzamelen. Weefselplakken zijn ook zeer toegankelijk voor fotostimulatie of medicijnafgifte voor optogenetische, chemogenetische of farmacologische experimenten.
Het hippocampale netwerk genereert zeer synchrone populatieactiviteit in vivo, zichtbaar als oscillaties in het extracellulaire lokale veldpotentieel1,2,3,4,5. Hersenschijfmethoden zijn gebruikt om inzicht te krijgen in de cellulaire en circuitmechanismen die ten grondslag liggen aan deze neuronale netwerkschommelingen. Fundamenteel werk van Maier et al. toonde aan dat scherpe golf-rimpelcomplexen (SWR's) spontaan kunnen ontstaan in plakjes van de ventrale hippocampus6,7. Latere studies van meerdere onderzoekers hebben geleidelijk vele aspecten van SWR 's opgehelderd, waaronder de rol van neuromodulatoren bij het reguleren van de netwerktoestand van de hippocampus8,9,10 en de synaptische mechanismen die de in vitro reactivering stimuleren van neuronale ensembles die eerder actief waren tijdens gedrag in vivo11. Hersensegmentexperimenten hebben ook inzicht gegeven in de oscillatie van het gammabereik (30-100 Hz), een duidelijke hippocampale netwerkstatus waarvan wordt aangenomen dat deze geheugencodering ondersteunt en12,13terugroept. Ten slotte, het erkennen van de centrale rol van de hippocampus en bijbehorende structuren in de pathofysiologie van temporale kwab epilepsie14,15, onderzoekers hebben hippocampale plakpreparaten gebruikt om de generatie en propagatie van epileptiforme activiteit te onderzoeken. Carter et al. toonden aan dat gecombineerde hippocampal-entorhinale cortex plakjes bereid van chronisch epileptische dieren spontaan epileptiforme afscheidingen kunnen genereren in vitro16. Vervolgens onderzochten Karlócai et al. de mechanismen die ten grondslag liggen aan epileptiforme lozingen in hippocampale plakjes met behulp van gemodificeerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met gewijzigde ionenconcentraties (verlaagde Mg2+ of verhoogde K+) of toegevoegde geneesmiddelen (4AP of gabazine)17.
Onderzoekers hebben tal van hippocampale segmentbenaderingen ontwikkeld die op belangrijke manieren verschillen: (1) het gebied van de hippocampus in de plak (dorsaal, gemiddeld of ventral); (2) de aan- of afwezigheid van extrahippocampale weefsels zoals de entorhinale cortex; (3) de oriëntatie die wordt gebruikt om plakjes te snijden (coronaal, sagittaal, horizontaal of schuin); en (4) de omstandigheden waaronder het weefsel wordt onderhouden na het snijden (volledig ondergedompeld in ACSF of vastgehouden op het raakvlak van ACSF en bevochtigde, carbogenrijke lucht).
De keuze van de gebruiksbenadering moet worden bepaald door de experimentele doelstelling. Transversale of coronale plakjes van de dorsale hippocampus die onder ondergedompelde omstandigheden worden gehouden , zijn bijvoorbeeld zeer effectief gebruikt voor het onderzoek naar intrahippocampale circuits en synaptische plasticiteit18,19,20. Dergelijke preparaten genereren echter niet spontaan netwerkschommelingen zo gemakkelijk als plakjes uit de ventrale hippocampus21,22,23. Hoewel een toestand van aanhoudende SWR-activiteit kan worden geïnduceerd door tetanische stimulatie in dwarse plakjes van de dorsale en ventrale hippocampus24, worden spontane SWR 's gemakkelijker waargenomen in ventrale plakjes7,25.
Een inherent fysiologisch en anatomisch onderscheid tussen de dorsale en ventrale hippocampus wordt ondersteund door studies die zowel in vivo als in vitro26zijn uitgevoerd . Opnames bij ratten toonden sterk coherente thetaritmes in de dorsale en intermediaire hippocampus, maar slechte samenhang tussen het ventrale gebied en de rest van de hippocampus27. SWR's in vivo vermeerderen zich gemakkelijk tussen de dorsale en intermediaire hippocampus, terwijl SWR's die afkomstig zijn uit de ventrale hippocampus vaak lokaal blijven28. De associatieprojecties afkomstig van CA3 piramidale neuronen die zich in de dorsale en intermediaire hippocampus bevinden, projecteren lange afstanden langs de lengteas van de hippocampus. CA3-projecties afkomstig uit ventrale regio 's blijven relatief lokaal en zullen dus minder snel worden doorgesneden tijdens het snijproces29,30. Ventrale segmenten kunnen daarom het terugkerende netwerk dat nodig is om populatiesynchronisatie te genereren, beter behouden. De neiging van ventrale segmenten om spontane netwerkactiviteiten in vitro te genereren , kan ook een hogere intrinsieke prikkelbaarheid van piramidale neuronen of zwakkere GABAergische remming in de ventrale hippocampus weerspiegelen in vergelijking met meer dorsale regio 's31. Ventrale hippocampale plakjes zijn inderdaad vatbaarder voor epileptiforme activiteit32,33. Zo hebben veel studies van spontane fysiologische8,9,11,24 of pathologische16,34, 35,36 netwerkschommelingen traditioneel een horizontale snijbenadering gebruikt, soms met een lichte hoek in de fronto-occipitale richting, die weefselschijfjes oplevert parallel aan het dwarsvlak van de ventrale hippocampus.
Netwerkconnectiviteit wordt onvermijdelijk beïnvloed door de snijprocedure, omdat veel cellen in het segment worden doorgesneden. De hoek en dikte van de plak en het weefsel dat in het preparaat wordt vastgehouden, moeten worden overwogen om de connectiviteit in de betrokken circuits te optimaliseren. Veel studies hebben horizontale gecombineerde hippocampal-entorhinale cortex slices (HEC) gebruikt om interacties tussen de twee structuren te verkennen in de context van fysiologische of pathologische netwerkschommelingen. Roth et al. voerden dubbele opnamen uit vanuit het CA1-subveld van de hippocampus en laag V van de mediale entorhinale cortex om de voortplanting van SWR-activiteit door het HEC-segment37aan te tonen. Veel studies naar epileptiforme activiteit hebben het HEC-plakpreparaat gebruikt om te onderzoeken hoe epileptiforme lozingen zich voortplanten via het corticohippocampale netwerk16,35,36,38. Het is belangrijk op te merken dat het behoud van de intacte corticohippocampale lus geen vereiste is voor spontane ZVR's, epileptiforme ontladingen of gamma-oscillaties; netwerkschommelingen kunnen worden gegenereerd in dwarssegmenten van de dorsale of ventrale hippocampus zonder aangebouwde parahippocampale weefsels21,22,23, 25,39,40,41. Een belangrijkere factor voor de spontane generatie van netwerkschommelingen in hippocampale segmenten kan de dikte van elke segment zijn, omdat een dikker segment (400-550 μm) meer connectiviteit in het CA2/CA3 terugkerende netwerk21,22,25zal behouden .
Hoewel schuine horizontale HEC-segmenten (gesneden met een hoek van ongeveer 12° in de fronto-occipitale richting) zijn gebruikt om de functionele connectiviteit van de corticohippocampale lus11,16,34,35,42te bestuderen , zijn dergelijke schuine preparaten niet vereist voor spontane netwerkactiviteit43,44,45. Het gebruik van een schuin snijvlak stelt de onderzoeker echter in staat om selectief plakjes te maken die het beste de transversaal georiënteerde lamellen van de ventrale of intermediaire hippocampus behouden, afhankelijk van het feit of een neerwaartse of een opwaartse hoek wordt toegepast (figuur 1). Deze benadering is conceptueel vergelijkbaar met die van Papatheodoropoulos et al., 2002, die elke hippocampus vrij ontleedden en vervolgens een weefselhelikopter gebruikten om dwarse plakjes te maken langs de hele dorsaal-ventrale as21. In het licht van het bovengenoemde functionele onderscheid tussen de ventrale en dorsaal-intermediaire hippocampus, moeten onderzoekers bij het ontwerpen van experimenten of het interpreteren van resultaten rekening houden met de anatomische oorsprong van plakjes. Het gebruik van een agar ramp tijdens de snijprocedure is een eenvoudige manier om bij voorkeur plakjes te produceren van de tussenliggende of ventrale hippocampus.
Hippocampale plakjes kunnen worden onderhouden in een ondergedompelde kamer (met het weefsel volledig ondergedompeld in ACSF), of een interface-achtige kamer (bijv. Oslo- of Haas-kamer, met plakjes die alleen worden bedekt door een dunne film van vloeiende media). Interfaceonderhoud verbetert de oxygenatie van het weefsel, wat de neuronale overleving bevordert en een aanhoudend hoog niveau van interneuronale activiteit mogelijk maakt. Traditioneel gebruiken ondergedompelde opnameomstandigheden een langzamer ACSF-debiet dat onvoldoende weefsel oxygenatie biedt voor stabiele expressie van oscillaties op netwerkniveau. In ondergedompelde hippocampale plakjes worden carbachol-geïnduceerde gamma-oscillaties slechts tijdelijk waargenomen46,47, terwijl ze stabiel kunnen worden onderhouden in interface-opnamekamers10,48,49. Als zodanig hebben veel studies naar complexe spontane activiteit in vitro vertrouwd op interface-opnamekamers om scherpegolfrimpelcomplexen6, 7,8,9,10,25,37, gamma-oscillaties10,13en epileptiforme activiteit16,38,45,47te onderzoeken .
In een opnamekamer in ondergedompelde stijl kan een onderdompelingsmicroscoopdoelstelling worden gebruikt om individuele cellen te visualiseren en selectief te richten op gezond uitziende cellen voor opnames. Het ondergedompelde preparaat maakt ook een fijne controle over het cellulaire milieu mogelijk, omdat onderdompeling een snelle verspreiding van geneesmiddelen of andere verbindingen naar het weefsel vergemakkelijkt. Een gewijzigde methodologie waarbij stabiele netwerkschommelingen onder ondergedompelde omstandigheden worden gehandhaafd, vertegenwoordigt dus een krachtige experimentele aanpak. Deze benadering wordt geïllustreerd door het werk van Hájos et al., waarin hippocampale plakjes zich enkele uren in een vereenvoudigde interface-achtige houdkamer herstellen voordat ze worden overgeplaatst naar een gewijzigde ondergedompelde opnamekamer met een hoog debiet van ACSF (~ 6 ml / min) om de zuurstoftoevoer naar het weefsel te verbeteren12,48,49. Onder deze omstandigheden kunnen hoge niveaus van interneuronactiviteit en stabiele spontane netwerkschommelingen in een ondergedompelde opnamekamer worden gehandhaafd. Deze gewijzigde aanpak stelt de onderzoekers in staat om visueel geleide hele-cel patchklemopnamen uit te voeren en de bijdrage van morfologisch geïdentificeerde celtypen aan carbachol-geïnduceerde gamma-oscillaties12te karakteriseren. SWR 's kunnen ook spontaan voorkomen in ondergedompelde hippocampale plakjes met een snel debiet van ACSF11,48,49. Maier et al. toonden aan dat hippocampale plakjes die zich in een interfacekamer herstelden voordat ze naar een ondergedompelde opnamekamer werden gebracht, op betrouwbare wijze spontane SWR's vertoonden, terwijl plakjes die zich vóór de overdracht naar een ondergedompelde opnamekamer onder water herstelden, kleinere opgeroepen veldreacties vertoonden, lagere niveaus van spontane synaptische stromen vertoonden en slechts zeer zelden spontane ZVR'svertoonden 43. Schlingloff et al. gebruikten deze verbeterde methodologie om de rol van parvalbumine-uitdrukkende mandcellen in de generatie van spontane SWR 's aan te tonen44.
Het volgende protocol presenteert een snijmethode waarmee spontaan actieve neuronen in horizontale hippocampale plakjes onder interfaceomstandigheden kunnen worden hersteld en vervolgens kunnen worden onderhouden in een ondergedompelde opnamekamer die geschikt is voor farmacologische of optogenetische manipulaties en visueel geleide opnamen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

Acute knaagdierhersenensnijden biedt een tracteerbare experimentele aanpak om inzicht te krijgen in de organisatie en functie van neurale circuits met eencellige resolutie met behulp van elektrofysiologie, microscopie en farmacologie. Een belangrijke overweging bij het ontwerp van in vitro experimenten is echter de mate waarin verschillende segmentpreparaten naturalistische patronen van neurale activiteit zoals waargenomen in vivo samenvatten. In de intacte hersenen genereert het hippocampale netwerk sterk gesynchroniseerde populatieactiviteit die de gedragstoestand van het dier weerspiegelt, zoals wordt geïllustreerd door de scherpegolfrimpelcomplexen (SWR's) die optreden tijdens het ontwaken van verbruikstoestanden of niet-REM-slaap. SWR's en andere vormen van netwerkactiviteit kunnen spontaan ontstaan in geïsoleerde hippocampale plakjes onder de juiste omstandigheden. Om de krachtige brain slice toolkit toe te passen op het onderzoek naar hippocampale netwerkactiviteit, is het noodzakelijk om een aanpak te gebruiken die de weefselgezondheid en het behoud van functionele connectiviteit binnen het hippocampale netwerk optimaliseert. Muizen zijn transcardieel doordrenkt met kunstmatige cerebrospinale vloeistof op basis van koude sucrose. Horizontale plakjes met de hippocampus worden gesneden met een dikte van 450 μm om synaptische connectiviteit te behouden. Plakjes herstellen zich in een interface-achtige kamer en worden overgebracht naar een ondergedompelde kamer voor opnames. De opnamekamer is ontworpen voor dubbele oppervlaktesuperfusie van kunstmatige cerebrospinale vloeistof met een hoog debiet om de oxygenatie van de plak te verbeteren. Dit protocol levert gezond weefsel op dat geschikt is voor het onderzoek van complexe en spontane netwerkactiviteit in vitro.

Hier worden representatieve opnames gepresenteerd van HEC-segmenten die zijn voorbereid zoals beschreven in dit protocol. Na herstel in een interfacehouderkamer (figuur 1C) worden plakjes afzonderlijk overgebracht naar een ondergedompelde opnamekamer (figuur 2B). De opnamekamer wordt geleverd met carbogen-verzadigde ACSF met behulp van een peristaltische pomp (figuur 2A). De pomp trekt eerst ACSF uit een snavel in een verwarmd reser...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

De combinatie van Transcranial Magnetic Stimulation en fMRI om de standaard-modus Netwerk Onderzoek

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Acute volwassen hersenen Snijden in Fysiologische Temperatuur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Inductie van een iso-elektrisch Brain staat om de impact van endogene synaptische activiteit op neuronale Exciteerbaarheid Onderzoek<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

Een preklinisch model om hersen herstel na acute beroerte bij ratten te beoordelen

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...