Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

המחבר רוצה להודות לסטיב סיגלבאום על התמיכה. המימון ניתן על ידי 5R01NS106983-02, כמו גם 1 F31 NS13466-01.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה (AC-AAAU9451).
1. הכנת פתרונות
<ol><li>הכינו פתרון חיתוך סוכרוז לחיתוך כמתואר בטבלה 1. הערה: לאחר הכנת 1 L של פתרון סוכרוז, להקפיא כמות קטנה (כ 100-200 מ"ל) במגש קרח. קוביות ק...

ישנם מספר צעדים בפרוטוקול חיתוך זה שנועד לקדם את בריאות הרקמות ולהעדיף את הופעתה של פעילות רשת נטורליסטית ספונטנית: העכבר חדור באופן טרנסקרדיאלי עם פתרון חיתוך סוכרוז מצונן; פרוסות קליפת המוח האופקית-סנטוריניאלית (HEC) נחתכות בעובי של 450 מיקרומטר מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני; פרוסות להתא?...

מדידה אלקטרופיזיולוגית מפרוסות היפוקמפוס חיות במבחנה היא גישה ניסיונית רבת עוצמה עם יתרונות רבים. הנסיין יכול להשתמש במיקרוסקופ, מיקרומניפולטורים ומערכת הקלטה כדי לדמיין ולאסוף מדידות ישירות מתאי עצב בודדים ברקמה. פרוסות רקמות נגישות מאוד גם לצילום או משלוח תרופות לניסויים אופטוגנטיים, כימוגנטיים או תרופתיים.
רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין סינכרונית מאוד ב vivo, גלוי כמו תנודות בפוטנציאל השדה המקומי חוץ תאי1,2,3,4,5. שיטות פרוסת המוח כבר ממונפות כדי לקבל תובנה לתוך מנגנוני הסלולר והמעגלים שבבסיס תנודות רשת עצביות אלה. עבודת יסוד של מאייר ואח 'הוכיחה כי מתחמי גלים חדים (SWRs) יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות של ההיפוקמפוס הגחוני6,7. מחקרים מאוחרים יותר של חוקרים מרובים הבהירו בהדרגה היבטים רבים של SWRs, כולל תפקידם של נוירומודולטורים בוויסות מצב הרשת של ההיפוקמפוס8,9,10 והמנגנונים הסינפטיים המניעים את ההפעלה מחדש במבחנה של הרכבים עצביים שהיו פעילים בעבר במהלך התנהגות ב vivo11. ניסויים בפרוסות מוח סיפקו גם תובנה על תנודות טווח הגמא (30-100 הרץ), מצב רשת היפוקמפוס מובהק האמין לתמוך קידוד זיכרון להיזכר12,13. לבסוף, הכרה בתפקיד המרכזי של ההיפוקמפוס ומבנים הקשורים בפתופיזיולוגיה של אפילפסיה של האונה הרקתית14,15, חוקרים השתמשו בהכנות פרוסת היפוקמפוס כדי לחקור את הדור ואת התפשטות פעילות אפילפטיפורם. Carter et al. הוכיחו כי פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-entorhinal בשילוב שהוכנו מבעלי חיים אפילפטיים כרוניים יכול ליצור באופן ספונטני הפרשות אפילפטיפורם במבחנה16. לאחר מכן, Karlócai et al. חקר את המנגנונים שבבסיס הפרשות אפילפטיפורם בפרוסות היפוקמפוס באמצעות נוזל שדרתי מלאכותי שונה (ACSF) עם ריכוזי יון שונה (מופחת Mg2+ או גבוה K+) או תרופות נוספות (4AP או gabazine)17.
חוקרים פיתחו גישות רבות של פרוסות היפוקמפוס השונות בדרכים מרכזיות: (1) אזור ההיפוקמפוס הכלול בפרוסה (גב, ביניים או גחון); (2) נוכחות או היעדר רקמות חוץ-פימפו-קמפליות כגון קליפת המוח האנטורינלית; (3) הכיוון המשמש לחיתוך פרוסות (קורנל, קשת, אופקי או אלכסוני); ו-(4) התנאים שבהם נשמרת הרקמה לאחר ההחתמה (שקועה במלואה ב- ACSF או מוחזקת בממשק של ACSF ואוויר לח ועשיר קרבוגן).
הבחירה באיזו גישה חותכת להשתמש צריכה להיקבע על ידי המטרה הניסיונית. לדוגמה, פרוסות רוחביות או קורנליות של ההיפוקמפוס הגבי המתוחזק בתנאים שקועים שימשו ביעילות רבה לחקירת מעגלים תוך-פיוקמפוסים ופלסטיות סינפטית18,19,20. עם זאת, הכנות כאלה אינן יוצרות באופן ספונטני תנודות ברשת בקלות כמו פרוסות מההיפוקמפוס הגחוני21,22,23. למרות מצב של פעילות SWR מתמשכת ניתן לגרום על ידי גירוי tetanic בפרוסות רוחביות מן ההיפוקמפוס הגבי הגחוני24, SWRs ספונטניים נצפו בקלות רבה יותר פרוסות הגחון7,25.
הבחנה פיזיולוגית ואנטומית אינהרנטית בין ההיפוקמפוס הגבי לבין ההיפוקמפוס הגחוני נתמכת על ידי מחקרים המבוצעים הן ב- vivo והן במבחנה26. הקלטות בחולדות חשפו מקצבי תטא עקביים מאוד לאורך ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, אך קוהרנטיות לקויה בין אזור הגחון לשאר ההיפוקמפוס27. SWRs ב vivo מפיצים בקלות בין ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, ואילו SWRs שמקורם בהיפוקמפוס הגחוני נשארים לעתיםקרובות מקומיים 28. התחזיות האסוציאטיביות שמקורן בנוירונים פירמידליים CA3 המתגוררים בפרויקט ההיפוקמפוס הגבי והבינוני למרחקים ארוכים לאורך הציר האורך של ההיפוקמפוס. תחזיות CA3 שמקורן באזורים גחוני להישאר מקומיים יחסית, ולכן נוטים פחות להיות מנותק במהלך תהליך ההחתכה29,30. לפיכך, פרוסות גחון עשויות לשמר טוב יותר את הרשת החוזרת הנחוצה ליצירת סנכרון אוכלוסין. הנטייה של פרוסות גחון כדי ליצור פעילויות רשת ספונטניות במבחנה עשויה גם לשקף רגישות פנימית גבוהה יותר של נוירונים פירמידליים או עיכוב GABAergic חלש יותר בהיפוקמפוס הגחוני בהשוואה לאזורים הגביים יותר31. ואכן, פרוסות היפוקמפוס הגחוני רגישים יותר לפעילות אפילפטיפורם32,33. לפיכך, מחקרים רבים של תנודות רשת ספונטניות8,9,11,24 או פתולוגי16,34,35,36 תנודות רשת השתמשו באופן מסורתי בגישה חתוכה אופקית, לפעמים עם זווית קלה בכיוון הקדמי-עורפי, אשר מניב פרוסות רקמה במקביל למישור הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני.
קישוריות הרשת מושפעת באופן בלתי נמנע מהליך ההחתכה, שכן תאים רבים בפרוסה ינותק. הזווית ועובי הפרוסה והרקמה שנשמרו בהכנה יש לשקול לייעל את הקישוריות במעגלי העניין. מחקרים רבים השתמשו בפרוסות קליפת המוח האופקית המשולבת של ההיפוקמפוס -entorhinal (HEC) כדי לחקור אינטראקציות בין שני המבנים בהקשר של תנודות רשת פיזיולוגיות או פתולוגיות. Roth et al. ביצע הקלטות כפולות משדה המשנה CA1 של ההיפוקמפוס ושכבה V של קליפת המוח האנטורינאלית המדיאלית כדי להדגים התפשטות של פעילות SWR באמצעות פרוסת HEC37. מחקרים רבים על פעילות אפילפטיפורם השתמשו בהכנת פרוסת HEC כדי לחקור כיצד הפרשות אפילפטיפורם מתפשטות דרך רשת קורטיקוהיפוקאמפל16,35,36,38. חשוב לציין כי שימור הלולאה קורטיקוהיפוקאמפל שלם אינו תנאי מוקדם עבור SWRs ספונטניים, הפרשות אפילפטיפורם, או תנודות גמא; תנודות רשת יכולות להיווצר בפרוסות רוחביות של ההיפוקמפוס הגבי או הגחוני ללא רקמות פרהיפוקמפוס מחוברות21,22,23, 25,39,40,41. גורם חשוב יותר עבור הדור הספונטני של תנודות רשת בפרוסות היפוקמפוס עשוי להיות עובי של כל פרוסה, כמו פרוסה עבה יותר (400-550 מיקרומטר) ישמור קישוריות יותר ברשת CA2/CA3 חוזרת21,22,25.
למרות פרוסות HEC אופקי זוויתי (לחתוך עם זווית של כ 12 ° בכיוון הקדמי-עורפי) שימשו כדי ללמוד את הקישוריות הפונקציונלית של לולאת corticohippocampal11,16,34,35,42, הכנות זוויתיות כאלה אינם נדרשים לפעילות רשת ספונטנית43,44,45. עם זאת, השימוש במישור חתך זוויתי מאפשר לחוקר להכין באופן סלקטיבי פרוסות המשמרות בצורה הטובה ביותר את הלאמלה בעלת הכיוון הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני או הבינוני, תלוי אם מוחלת זווית כלפי מטה או כלפי מעלה (איור 1). גישה זו דומה מבחינה מושגית לזו המשמשת את Papatheodoropoulos et al., 2002, אשר ניתח כל היפוקמפוס חינם ולאחר מכן השתמש במסוק רקמות כדי ליצור פרוסות רוחביות לאורך כל ציר הגב הגחוני21. לאור ההבחנה התפקודית הנ"ל בין ההיפוקמפוס הגחוני והידוכי הגבי, החוקרים צריכים לשקול את המקור האנטומי של פרוסות בעת תכנון ניסויים או פרשנות תוצאות. שימוש ברמפת אגר במהלך הליך ההחתכה הוא דרך פשוטה לייצר פרוסות מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני.
פרוסות היפוקמפוס יכולות להישמר בתא שקוע (עם הרקמה שקועה לחלוטין ב- ACSF), או בתא בסגנון ממשק (למשל, אוסלו או תא האס, עם פרוסות מכוסות רק על ידי סרט דק של מדיה זורמת). תחזוקת ממשק משפר חמצון של הרקמה, אשר מקדם הישרדות עצבית ומאפשר רמות גבוהות מתמשכת של פעילות interneuronal. באופן מסורתי, תנאי הקלטה שקועים משתמשים בקצב זרימה ACSF איטי יותר שאינו מספק חמצון רקמות נאות לביטוי יציב של תנודות ברמת הרשת. בפרוסות היפוקמפוס שקועות תנודות גמא הנגרמות על ידי קרבאכול נצפו רק באופן ארעי46,47, בעוד שהם יכולים להישמר ביציבות בתאי הקלטה ממשק10,48,49. ככזה, מחקרים רבים של פעילות ספונטנית מורכבת במבחנה הסתמכו על חדרי הקלטה ממשק לחקור מתחמי גל חדאדווה 6,7,8,9,10,25,37, תנודות גמא10,13, ופעילות אפילפטיפורם16,38,45,47.
בתא הקלטה בסגנון שקוע, ניתן להשתמש במטרה של מיקרוסקופ טבילה כדי לדמיין תאים בודדים ולמקד באופן סלקטיבי תאים בעלי מראה בריא להקלטות. ההכנה שקועה גם מאפשר שליטה עדינה על milieu הסלולר, כמו טבילה מקלה על פיזור מהיר של תרופות או תרכובות אחרות לרקמה. לפיכך, מתודולוגיה שונה שבה תנודות רשת יציבות נשמרות בתנאים שקועים מייצגת גישה ניסיונית רבת עוצמה. גישה זו באה לידי ביטוי על ידי העבודה של Hájos et al., שבו פרוסות ההיפוקמפוס להתאושש בתא החזקה בסגנון ממשק פשוט במשך כמה שעות לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע שונה עם קצב זרימה גבוה של ACSF (~ 6 mL / min) כדי לשפר את אספקת החמצן לרקמה12,48,49. בתנאים אלה, ניתן לשמור על רמות גבוהות של פעילות interneuron ותנודת רשת ספונטנית יציבה בתא הקלטה שקוע. גישה זו שונה מאפשרת לחוקרים לבצע הקלטות תיקון תא שלם מונחה חזותית ולאפיין את תרומתם של סוגי תאים שזוהו מורפולוגית לתנודות גמא הנגרמות על ידי carbachol12. SWRs יכול להתרחש גם באופן ספונטני פרוסות היפוקמפוס שקוע עם קצב זרימה מהיר של ACSF11,48,49. מאייר ואח ' הדגימו כי פרוסות היפוקמפוס שהתאוששו בתא ממשק לפני המעבר לתא הקלטה שקוע הציגו באופן אמין SWRs ספונטניים, ואילו פרוסות שהתאוששו שקועות בכומתה לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע הראו תגובות שדה קטנות יותר, רמות נמוכות יותר של זרמים סינפטיים ספונטניים, ורק לעתים רחוקות מאוד הציגו SWRsספונטניים 43. Schlingloff et al. השתמשו במתודולוגיה משופרת זו כדי להדגים את תפקידם של תאי סל מבטאים parvalbumin בדור של SWRs ספונטני44.
הפרוטוקול הבא מציג שיטת חתך שבאמצעותה ניתן לשחזר נוירונים פעילים באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס אופקיות בתנאי ממשק ולאחר מכן להישמר בתא הקלטה שקוע המתאים למניפולציות תרופתיות או אופטוגנטיות והקלטות מונחות ויזואלית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

חריף קוסמים במוח מציע גישה ניסיונית ניתנת להפעלה כדי לקבל תובנות על הארגון והתפקוד של מעגלים עצביים עם רזולוציה של תא יחיד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, מיקרוסקופיה ופרמקולוגיה. עם זאת, שיקול מרכזי בתכנון ניסויים במבחנה הוא המידה שבה תכשירי פרוסות שונים מסכמים מחדש דפוסים נטורליסטיים של פעילות עצבית כפי שנצפו ב- vivo. במוח שלם, רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין מסונכרנת מאוד המשקפת את המצב ההתנהגותי של החיה, כפי שבא לידי ביטוי בתסביכי הגלים החדים (SWRs) המתרחשים במהלך מצבי ההתעוררות או השינה שאינה REM. SWRs וצורות אחרות של פעילות רשת יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס מבודדות בתנאים מתאימים. על מנת ליישם את ערכת הכלים החזקה של פרוסת המוח על חקירת פעילות רשת ההיפוקמפוס, יש צורך להשתמש בגישה המייעלת את בריאות הרקמות ושמירה על קישוריות תפקודית בתוך רשת ההיפוקמפוס. עכברים נוטרים באופן טרנס-קרדיאלי נוזל שדרתי מלאכותי קר המבוסס על סוכרוז. פרוסות אופקיות המכילות את ההיפוקמפוס נחתכות בעובי של 450 מיקרומטר כדי לשמר קישוריות סינפטית. פרוסות מתאוששות בתא בסגנון ממשק ומועברות לתא שקוע להקלטות. תא ההקלטה מיועד לתדלוק כפול של נוזל שדרתי מלאכותי בקצב זרימה גבוה כדי לשפר את החמצון של הפרוסה. פרוטוקול זה מניב רקמה בריאה המתאימה לחקירת פעילות רשת מורכבת וספונטנית במבחנה.

מוצגות להלן הקלטות מייצגות מפרוסות HEC שהוכנו כמתואר בפרוטוקול זה. לאחר התאוששות בתא מעצר ממשק (איור 1C), פרוסות מועברות בנפרד לתא הקלטה שקוע (איור 2B). תא ההקלטה מסופק עם ACSF רווי קרבוגן באמצעות משאבה פריסטלית(איור 2A). המשאבה שואבת תחילה ACSF מן הכף...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאלית האופקית (HEC) מעכברים המציגים פעילות אדווה ספונטנית של גל חד. פרוסות מודגרות בתא החזקת ממשק פשוט והקלטות מבוצעות בתנאים שקועים עם נוזל שדרתי מלאכותי זורם במהירות כדי לקדם חמצון רקמות ואת הופעתה הספונטנית של פעילות ברמת הרשת.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

שילוב של גירוי מגנטי fMRI Transcranial ולבחון את רשת מצב ברירת מחדל

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

אינדוקציה של מדינת איזואלקטרית מוח כדי לחקור את ההשפעה של פעילות סינפטית אנדוגני על העצבית רגישה<em&gt; In vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

מודל טרום קליני להעריך את ההתאוששות המוח לאחר שבץ חריף בחולדות

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

הכנת פרוסות היפוקמפוס אנושיות חריפות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...