Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
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著者はスティーブ・ジーゲルバウムのサポートに感謝したいと思います。資金は5R01NS106983-02と1 F31 NS113466-01によって提供されます。

ここで説明するすべての方法は、コロンビア大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されています (AC-AAAU9451).
1. ソリューションの準備
<ol><li>表1に記載されているように、スクロース切断液をスライス用に用意する。 注:1 Lのショ糖溶液を調製した後、少量(約100〜200mL)を氷トレイに凍らせます。これらの冷凍スクロースアイスキュー?...

組織の健康を促進し、自発的な自然主義的なネットワーク活動の出現を支持するように設計されたこのスライスプロトコルにはいくつかのステップがあります:マウスは、チルドショ糖切断溶液で経皮的に浸透しています。水平内膜皮質(HEC)スライスは、中間または腹側海馬から450μmの厚さで切断されます。スライスは、温めたACSFのインターフェースで回復し、加湿された、カルボゲンが豊富...

生体外の生きた海馬スライスからの電気生理学的測定は、多くの利点を有する強力な実験的アプローチである。実験者は顕微鏡、マイクロマニピュレーター、および記録システムを使用して、組織内の個々のニューロンから測定値を直接可視化し、収集することができます。組織スライスは光遺伝学的、化学遺伝学的、または薬理学的実験のための光刺激または薬物送達にも非常にアクセス可能である。
海馬ネットワークは、生体内で高度に同期的な集団活動を生成し、細胞外局所的なフィールドポテンシャル1、2、3、4、5の振動として見える。脳スライス法は、これらの神経ネットワーク振動の根底にある細胞および回路メカニズムに関する洞察を得るために活用されてきた。Maierらの基礎的な研究は、鋭波波波紋成(SRS)が腹側海馬6,7のスライスに自発的に出現できることを実証した。複数の研究者からのその後の研究は、海馬8、9、10のネットワーク状態を調節する神経調節因子の役割およびvivo11での行動の間に以前に活動していた神経アンサンブルのインビトロ再活性化を促進するシナプス機構を含む、SDRの多くの側面を徐々に解明してきた。脳スライス実験はまた、ガンマ範囲振動(30〜100Hz)、記憶符号化とリコール12、13をサポートすると考えられている明確な海馬ネットワーク状態への洞察を提供している。最後に、側頭葉てんかん14,15の病態生理学における海馬および関連する構造の中心的役割を認識し、研究者は海馬スライス製剤を使用しててんかん活動の発生および伝播を調査した。Carterららは、慢性てんかん動物から調製された海馬-内皮質スライスを組み合わせることで、vitro16で自発的にてんかん放電を発生させることができることを実証した。その後、Karlócaiらは、改変されたイオン濃度(Mg2+または上昇K+)または薬物(4APまたはガバジン)17を有する改変された人工脳脊髄液(ACSF)を用いて海馬スライス中のてんかん分泌物の基礎となるメカニズムを探った。
研究者は、重要な方法で異なる多数の海馬スライスアプローチを開発しました:(1)スライスに含まれる海馬の領域(側線、中間体、または腹側);(2)内皮質などの海馬外組織の有無。(3)スライス(コロナ、矢状、水平、または斜め)をカットするために使用される方向。(4)スライス後に組織が維持される条件(ACSFに完全に沈水するか、ACSFのインターフェースで保持され、加湿された、カルボゲンが豊富な空気)。
どのスライスアプローチを使用するかを選択することは、実験目的によって決定されるべきである。例えば、水没条件下で維持された眼海馬の横方向またはコロナスライスは、海馬内回路およびシナプス可塑性18、19、20の調査に非常に有効に使用されてきた。しかし、このような調製物は、腹側海馬21、22、23からのスライスほど容易にネットワーク振動を発生させるものではない。持続的なSWR活性の状態は、背側および腹側海馬24からの横切りスライスにおけるテタニック刺激によって誘発され得るが、腹側スライス7,25において自発的なSWRがより容易に観察される。
側方海馬と腹側海馬の間に固有の生理学的および解剖学的な区別は、生体内およびインビトロ26の両方で行われる研究によって支えられている。ラットにおける記録は、側腹および中間海馬全体にわたって強く一貫したシータリズムを明らかにしたが、腹側領域と海馬27の残りの部分との間の一貫性が悪い。生体内のSRSは、裏側海馬と中間海馬の間で容易に伝播し、腹側海馬に由来するSDRはしばしば局所的な28のままである。海馬の縦軸に沿って、裏側および中間海馬に存在するCA3錐体ニューロンに由来する関連投影法。腹側領域から発生するCA3投影は比較的局所的であり、したがって、スライスプロセス29、30の間に切断される可能性が低い。したがって、腹側スライスは、人口同期を生成するために必要な繰り返しネットワークをよりよく保存する可能性があります。vitroで自発的なネットワーク活動を発生させる腹側スライスの傾向は、より多くの側側領域31と比較して、錐体ニューロンの高い固有興奮性または腹側海馬におけるGABAergic阻害の高い固有の興奮性を反映してもよい。確かに、腹側海馬のスライスは、てんかん活動32、33に対してより敏感である。したがって、自発的な生理学的8、9、11、24または病理学的16、34、35、36ネットワーク振動の多くの研究は、伝統的に、時には腹側海馬の横面に平行な組織スライスを生み出す前頭後頭方向にわずかな角度で、水平スライスアプローチを使用してきました。
スライス処理によって、スライスの多くのセルが切断されることで、ネットワーク接続が不可避的に影響を受けます。目的の回路の接続性を最適化するために、準備中に保持されるスライスと組織の角度と厚さを考慮する必要があります。多くの研究は、生理学的または病理学的ネットワーク振動の文脈で2つの構造間の相互作用を探求するために水平結合海馬-内皮質スライス(HEC)を利用しています。Rothらは、海馬のCA1サブフィールドと内側の内皮質の層Vから二重記録を行い、HECスライス37を通してSWR活性の伝播を実証した。てんかんの活動の多くの研究は、てんかんの排出がコルチコヒッポカンネットワーク16、35、36、38を介して伝播する方法を調査するためにHECスライス調製を使用しています。無傷のコルチコヒッポカンピカルループの保存は、自発的なSVR、てんかんの排出、またはガンマ振動の前提条件ではないことを注意することが重要です。ネットワーク振動は、付着した海馬組織21、22、23、25、39、40、41を伴わない、側側または腹側海馬の横切れスライスで生成することができる。海馬スライスにおけるネットワーク振動の自発的発生のためのより重要な要因は、厚いスライス(400〜550 μm)がCA2/CA3の再発ネットワーク21、22、25でより多くの接続を維持するので、各スライスの厚さである可能性があります。
角度付き水平HECスライス(前頭部後頭部方向に約12°の角度でカット)は、コルチコヒッポカンピカルループ11、16、34、35、42の機能的接続性を研究するために使用されてきたが、そのような斜めの準備は、自発的なネットワーク活動43、44、45のために必要とされない。しかし、斜めのスライス平面を使用すると、下向きまたは上向きの角度が適用されるかに応じて、研究者が腹側または中間海馬の横方向の層板を最もよく保存するスライスを選択的に作成することができます(図1)。このアプローチは、パパテオドロプロスら、2002年に使用される方法と概念的に似ており、各海馬を自由に解剖し、組織チョッパーを使用して、側腹側全軸21に沿って横切りスライスを作成した。腹側と側側中海馬の機能的な区別に照らして、研究者は実験を設計したり結果を解釈したりする際に、スライスの解剖学的起源を考慮する必要があります。スライス手順中に寒天ランプを使用することは、中間海馬または腹側海馬のいずれかからスライスを優先的に生成する簡単な方法です。
海馬スライスは、水没したチャンバー(組織がACSFに完全に浸漬された)またはインターフェイススタイルのチャンバー(例えば、オスロまたはハースチャンバー、流れる媒体の薄膜のみで覆われたスライス)のいずれかで維持することができます。インターフェースの維持は、組織の酸素化を促進し、神経細胞の生存を促進し、ニューロン間活動の持続的な高レベルを可能にする。従来、沈められた記録条件は、ネットワークレベル振動の安定した発現のために十分な組織酸素化を提供しない、より遅いACSF流量を使用する。水没した海馬スライスでは、カルバコール誘発ガンマ振動は一過性に観察されるだけであるが、それらは界面記録室10、48、49で安定的に維持することができる。このように、vitroの複雑な自発的活動の多くの研究は、鋭波波波の複合体6、7、8、9、10、25、37、ガンマ振動10、38、45、47を調査するためにインターフェース記録室に依存してきました。
水没式記録室では、浸漬顕微鏡の目的を使用して個々の細胞を可視化し、記録のために健康的な細胞を選択的にターゲットにすることができます。水没した製剤はまた、水没が組織への薬物または他の化合物の急速な拡散を促進するので、細胞ミリューを細かく制御することを可能にする。したがって、水没条件下で安定したネットワーク振動が維持される修正方法論は、強力な実験アプローチを表す。このアプローチは、組織12、48、49への酸素供給を増強するためにACSF(〜6 mL/min)の高い流量を有する改変された水没記録室に移る前に、海馬スライスが簡略化されたインターフェーススタイルの保持室で数時間回復するハホスらの働きによって例示される。これらの条件下では、高レベルのニューロン間活動と安定した自発的ネットワーク振動を、水中記録室に維持することができる。この変更アプローチにより、研究者は視覚的に誘導された全細胞パッチクランプ記録を行い、形態学的に同定された細胞タイプがカルバコール誘導ガンマ振動12に寄与することを特徴付けることを可能にする。SRS は、ACSF11、48、49の速い流量を持つ水没した海馬スライスでも自然発生する可能性があります。Maierら et al. 水没した記録室に移る前にインターフェース室で回収された海馬スライスが確実に自発的なSWRを示したのに対し、水没した記録室に移る前にビーカーに沈んだスライスは、より小さな呼び起動場応答を示し、自発的なシナプス電流のレベルが低く、自発的なSWR43を示すことはほとんどありませんでした。Schlingloffらは、この改良された方法論を用いて、自発的なSRS44の生成におけるパルブアルブミン発現バスケット細胞の役割を実証した。
次のプロトコルは、水平海馬スライス中の自発的に活動するニューロンを界面条件下で回収し、その後、薬理学的または光遺伝学的操作および視覚的に導かれた記録に適した水没記録室で維持することができるスライス法を提示する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

急性げっ歯類の脳スライスは、電気生理学、顕微鏡法、薬理学を用いた単細胞分解能を用いた神経回路の組織と機能に関する洞察を得るための、難解な実験的アプローチを提供します。しかし、 インビトロ 実験の設計における大きな考慮事項は、異なるスライス調製物が 、生体内で 観察される神経活動の自然主義的パターンをどの程度再現するかを示す。無傷の脳では、海馬ネットワークは、覚めの完了状態または非レム睡眠中に起こる鋭波波性複合体(SRS)によって例示されるように、動物の行動状態を反映する高度に同期した集団活動を生成する。SRSおよび他の形態のネットワーク活動は、適切な条件下で孤立した海馬スライス中に自発的に出現する可能性がある。強力な脳スライスツールキットを海馬ネットワーク活動の調査に適用するためには、組織の健康と海馬ネットワーク内の機能的な接続性の維持を最適化するアプローチを利用する必要があります。マウスは、経皮的に冷たいショ糖ベースの人工脳脊髄液と浸透する。海馬を含む水平スライスは、シナプス接続性を維持するために450 μmの厚さで切断されます。スライスはインターフェイススタイルのチャンバで回復し、記録のために水没した部屋に移される。記録室はスライスの酸素化を改善するために高流量の人工脳脊髄液の二重表面の重ね合たちのために設計されている。このプロトコルは、複雑で自発的なネットワーク活動の調査に適した健康な組織 をvitroで生成します。

ここでは、このプロトコルで説明したように準備されたHECスライスからの代表的な録音を示します。インターフェース保持室(図1C)での回復後、スライスは水没した記録室に個別に移される(図2B)。記録チャンバには、蠕動ポンプを用いてカルボゲン飽和ACSFが供給される(図2A)。ポンプは最初に保持ビーカーから熱い貯蔵所にACS...

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Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

デフォルトモードのネットワークを検査する経頭蓋磁気刺激とfMRIを組み合わせ

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

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Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

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等電点電気泳動脳の状態の誘導は、神経細胞の興奮に内因性シナプス活性の影響を調査するために、<em&gt;インビボ</em

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Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

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Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

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Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

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Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...