Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Forfatteren vil gjerne takke Steve Siegelbaum for støtte. Det gis midler fra 5R01NS106983-02 samt 1 F31 NS113466-01.

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Klargjør løsninger
<ol><li>Forbered sukroseskjæreoppløsning for kutting som beskrevet i tabell 1. MERK: Etter at du har klargjør 1 L sukroseoppløsning, må du fryse en liten mengde (ca. 100–200 ml) i et isbrett. Disse frosne sukroseisbitene vil bli blandet inn i en isete slurry (se trinn 4.3).</li>
	<li>Klar...

Det er flere trinn i denne kutteprotokollen designet for å fremme vevshelse og favorisere fremveksten av spontan naturalistisk nettverksaktivitet: musen er transcardially perfused med kjølt sukrose kutte løsning; horisontal-entorhinal cortex (HEC) skiver er kuttet med en tykkelse på 450 μm fra mellomliggende eller ventral hippocampus; skiver gjenopprette på grensesnittet av oppvarmet ACSF og fuktet, karbagen-rik luft; under opptak skiver er superfundert med ACSF varmet til 32 ° C og leveres med en rask strømnings...

Elektrofysiologiske målinger fra levende hippocampal skiver in vitro er en kraftig eksperimentell tilnærming med mange fordeler. Eksperimentereren kan bruke et mikroskop, mikromanipulatorer og et opptakssystem for å visualisere og samle målinger direkte fra individuelle nevroner i vevet. Vevskiver er også svært tilgjengelige for fotostimulering eller legemiddellevering for optogenetiske, kjemiskogenetiske eller farmakologiske eksperimenter.
Hippocampal nettverket genererer svært synkron befolkningsaktivitet in vivo, synlig som svingninger i det ekstracellulære lokale feltetpotensial 1,2,3,4,5. Brain slice metoder har blitt utnyttet for å få innsikt i cellulære og krets mekanismer underliggende disse nevronale nettverk svingninger. Grunnleggende arbeid fra Maier et al. viste at skarpe bølge-krusning komplekser (SWRs) kan dukke opp spontant i skiver av ventral hippocampus6,7. Etterfølgende studier fra flere forskere har gradvis belyst mange aspekter av SWRs, inkludert rollen som nevromodulatorer i å regulere nettverkstilstanden til hippocampus8,9,10 og de synaptiske mekanismene som driver in vitro reaktivering av nevronale ensembler som tidligere var aktive under atferd in vivo11. Hjerneskiver eksperimenter har også gitt innsikt i gamma rekkevidde oscillasjon (30-100 Hz), en distinkt hippocampal nettverkstilstand antas å støtte minne koding og tilbakekalling12,13. Til slutt, gjenkjenne den sentrale rollen hippocampus og tilhørende strukturer i patofysiologien til temporal lobe epilepsi14,15, forskere har brukt hippocampal skive preparater for å undersøke generering og forplantning av epileptiform aktivitet. Carter et al. demonstrerte at kombinerte hippocampal-entorhinal cortex skiver tilberedt av kronisk epileptiske dyr kan spontant generere epileptiform utslipp in vitro16. Deretter utforsket Karlócai et al. mekanismene underliggende epileptiform utslipp i hippocampal skiver ved hjelp av modifisert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med endrede isjonskonsentrasjoner (redusert Mg2 + eller forhøyet K+) eller lagt narkotika (4AP eller gabazine)17.
Etterforskere har utviklet mange hippocampal skive tilnærminger som varierer på viktige måter: (1) regionen av hippocampus som finnes i stykket (dorsal, middels, eller ventral); (2) tilstedeværelse eller fravær av ekstrahippocampal vev som entorhinal cortex; (3) orienteringen som brukes til å kutte skiver (koronar, sagittal, horisontal eller skrå); og (4) forholdene der vevet opprettholdes etter kutting (nedsenket fullt ut i ACSF eller holdt i grensesnittet til ACSF og fuktet, karbagenrik luft).
Valget av hvilken kutte tilnærming til bruk bør bestemmes av det eksperimentelle målet. For eksempel har tverrgående eller koronale skiver av den dorsale hippocampus opprettholdt under nedsenket forhold blitt brukt svært effektivt for undersøkelse av intrahippocampal kretser og synaptisk plastisitet18,19,20. Imidlertid genererer slike preparater ikke spontant nettverkssvingninger så lett som skiver fra ventral hippocampus21,22,23. Selv om en tilstand av vedvarende SWR-aktivitet kan induseres ved tetanisk stimulering i tverrgående skiver fra dorsal og ventral hippocampus24,observeres spontane SWRs lettere i ventrale skiver7,25.
Et iboende fysiologisk og anatomisk skille mellom dorsal og ventral hippocampus støttes av studier utført både in vivo og in vitro26. Opptak hos rotter avslørte sterkt sammenhengende theta rytmer gjennom dorsal og mellomliggende hippocampus, men dårlig sammenheng mellom ventral regionen og resten av hippocampus27. SwRs in vivo forplanter seg lett mellom dorsal og mellomliggende hippocampus, mens SWRs som stammer fra ventral hippocampus ofte forblir lokale28. De assosiasjonelle projeksjonene stammer fra CA3 pyramidale nevroner som bor i den dorsale og mellomliggende hippocampus prosjektet lange avstander langs den langsgående aksen av hippocampus. CA3-projeksjoner som kommer fra ventrale regioner forblir relativt lokale, og dermed er mindre sannsynlig å bli kuttet underkuttingsprosessen 29,30. Ventrale skiver kan derfor bedre bevare det tilbakevendende nettverket som er nødvendig for å generere befolkningssynkronisering. Tilbøyeligheten til ventrale skiver for å generere spontane nettverksaktiviteter in vitro kan også gjenspeile høyere iboende spenning av pyramidale nevroner eller svakere GABAergic hemming i ventral hippocampus sammenlignet med mer dorsale regioner31. Ventrale hippocampalskiver er faktisk mer utsatt for epileptiform aktivitet32,33. Dermed har mange studier av spontanefysiologiske 8,9,11,24 ellerpatologisk 16,34,35,36 nettverkssvingninger tradisjonelt brukt en horisontal kutting tilnærming, noen ganger med en liten vinkel i fronto-occipital retning, som gir vevskiver parallelt med det tverrgående planet av ventral hippocampus.
Nettverkstilkobling påvirkes uunngåelig av kuttprosedyren, da mange celler i stykket vil bli kuttet. Vinkelen og tykkelsen på skiven og vevet som beholdes i preparatet, bør vurderes for å optimalisere tilkoblingen i kretsene av interesse. Mange studier har benyttet horisontale kombinerte hippocampal-entorhinal cortex skiver (HEC) for å utforske interaksjoner mellom de to strukturene i sammenheng med fysiologiske eller patologiske nettverkssvingninger. Roth et al. utførte to opptak fra CA1-underfeltet i hippocampus og lag V av den mediale entorhinale cortex for å demonstrere forplantning av SWR-aktivitet gjennom HEC-skive37. Mange studier av epileptiform aktivitet har brukt HEC skive forberedelse til å undersøke hvordan epileptiform utslipp forplanter seg gjennom kortikohippocampal nettverk16,35,36,38. Det er viktig å merke seg at bevaring av intakt kortikohippocampal sløyfe ikke er en forutsetning for spontane SWRs, epileptiform utslipp, eller gamma svingninger; nettverkssvingninger kan genereres i tverrgående skiver av dorsal eller ventral hippocampus uten vedlagte parahippocampal vev21,22,23, 25,39,40,41. En viktigere faktor for spontan generering av nettverkssvingninger i hippocampal skiver kan være tykkelsen på hver skive, som en tykkere skive (400-550 μm) vil bevare mer tilkobling i CA2 / CA3 tilbakevendendenettverk 21,22,25.
Selv om vinklede horisontale HEC skiver (kuttet med en ca 12° vinkel i fronto-occipital retning) har blitt brukt til å studere funksjonell tilkobling av kortikohippocampal loop11,16,34,35,42, slike vinklede preparater er ikke nødvendig for spontan nettverksaktivitet43,44,45. Imidlertid tillater bruk av et vinklet skjæreplan utprøver å selektivt lage skiver som best bevarer den tverrgående orienterte lamelleren av enten ventral eller mellomliggende hippocampus, avhengig av om en nedadgående eller en oppadgående vinkel påføres (figur 1). Denne tilnærmingen er konseptuelt lik den som brukes av Papatheodoropoulos et al., 2002, som dissekerte hver hippocampus fri og deretter brukte et vevshelikopter for å lage tverrgående skiver langs hele dorsal-ventralaksen 21. I lys av de nevnte funksjonelle forskjellene mellom ventral og dorsal-intermediate hippocampus, bør etterforskerne vurdere den anatomiske opprinnelsen til skiver når de utformer eksperimenter eller tolker resultater. Ved hjelp av en agarrampe under kuttingsprosedyren er en enkel måte å fortrinnsvis produsere skiver fra enten mellomliggende eller ventral hippocampus.
Hippocampal skiver kan opprettholdes i enten et nedsenket kammer (med vevet fullt nedsenket i ACSF), eller et grensesnitt-stil kammer (f.eks Oslo eller Haas kammer, med skiver dekket bare av en tynn film av flytende medier). Grensesnittvedlikehold forbedrer oksygenering av vevet, noe som fremmer nevronal overlevelse og gir mulighet for vedvarende høye nivåer av internuronal aktivitet. Tradisjonelt bruker nedsenkede opptaksforhold en langsommere ACSF-strømningshastighet som ikke gir tilstrekkelig vevs oksygenering for stabilt uttrykk for svingninger på nettverksnivå. I nedsenket hippocampal skiver carbachol-indusert gamma svingninger er bare observertforbigående 46,47, mens de kan stabilt opprettholdes i grensesnitt opptakskamre10,48,49. Som sådan har mange studier av kompleks spontan aktivitet in vitro stolt på grensesnittopptakskamre for å undersøke skarpbølgekrustningskomplekser6,7,8,9,10,25,37,gammasvingninger10,13og epileptiform aktivitet16,38,45,47.
I et opptakskammer i nedsenket stil kan et mål om nedsenking av mikroskop brukes til å visualisere individuelle celler og selektivt målrette mot friske celler for opptak. Det nedsenkede preparatet gir også fin kontroll over det cellulære miljøet, da nedsenking letter rask diffusjon av narkotika eller andre forbindelser til vevet. Dermed representerer en modifisert metodikk der stabile nettverkssvingninger opprettholdes under nedsenkede forhold en kraftig eksperimentell tilnærming. Denne tilnærmingen er eksemplifisert av arbeidet til Hájos et al., der hippocampal skiver gjenopprette i et forenklet grensesnitt-stil holder kammer i flere timer før overføring til en modifisert nedsenket opptakskammer med en høy strømningshastighet på ACSF (~ 6 ml / min) for å forbedre oksygentilførselen tilvevet 12,48,49. Under disse forholdene kan høye nivåer av internuronaktivitet og stabile spontane nettverkssvingninger opprettholdes i et nedsenket opptakskammer. Denne modifiserte tilnærmingen gjør det mulig for etterforskerne å utføre visuelt veiledede helcellede patchklemmeopptak og karakterisere bidraget fra morfologisk identifiserte celletyper til karbachol-induserte gammasvingninger12. SwRs kan også oppstå spontant i nedsenket hippocampal skiver med en rask strømningshastighet på ACSF11,48,49. Maier et al. demonstrerte at hippocampal skiver som gjenopprettet i et grensesnittkammer før overføring til et nedsenket opptakskammer pålitelig utstilt spontane SWRs, mens skiver som gjenopprettet nedsenket i et beger før overføring til et nedsenket opptakskammer viste mindre fremkalte feltresponser, lavere nivåer av spontansynaptiske strømmer, og bare svært sjelden utstilt spontane SWRs43. Schlingloff et al. brukte denne forbedrede metodikken til å demonstrere rollen som parvalbumin-uttrykkende kurvceller i generasjonen spontane SWRs44.
Følgende protokoll presenterer en skjæremetode der spontant aktive nevroner i horisontale hippocampalskiver kan gjenopprettes under grensesnittforhold og deretter opprettholdes i et nedsenket opptakskammer egnet for farmakologiske eller optogenetiske manipulasjoner og visuelt veiledede opptak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

Akutt gnagerhjerneslicing gir en tractable eksperimentell tilnærming for å få innsikt i organiseringen og funksjonen til nevrale kretser med encelleoppløsning ved hjelp av elektrofysiologi, mikroskopi og farmakologi. Imidlertid er en viktig vurdering i utformingen av in vitro eksperimenter i hvilken grad forskjellige skivepreparater rekafulerer naturalistiske mønstre av nevrale aktivitet som observert in vivo. I den intakte hjernen genererer hippocampalnettverket svært synkronisert befolkningsaktivitet som reflekterer dyrets atferdstilstand, som eksemplifisert av skarpbølgekrustningskompleksene (SWRs) som oppstår under våkne forbrukstilstander eller ikke-REM-søvn. SWRs og andre former for nettverksaktivitet kan dukke opp spontant i isolerte hippocampal skiver under passende forhold. For å bruke den kraftige hjerneskive verktøykassen til undersøkelse av hippocampal nettverksaktivitet, er det nødvendig å bruke en tilnærming som optimaliserer vevshelse og bevaring av funksjonell tilkobling i hippocampalnettverket. Mus er transcardially perfused med kald sukrose-basert kunstig cerebrospinalvæske. Horisontale skiver som inneholder hippocampus er kuttet med en tykkelse på 450 μm for å bevare synaptisk tilkobling. Skiver gjenopprette i et grensesnitt-stil kammer og overføres til et nedsenket kammer for opptak. Opptakskammeret er designet for dobbel overflate superfusjon av kunstig cerebrospinalvæske ved høy strømningshastighet for å forbedre oksygeneringen av skiven. Denne protokollen gir sunt vev egnet for undersøkelse av komplekse og spontane nettverksaktivitet in vitro.

Presentert her er representative opptak fra HEC skiver utarbeidet som beskrevet i denne protokollen. Etter utvinning i et grensesnitt holder kammer (Figur 1C), skiver overføres individuelt til et nedsenket opptakskammer (figur 2B). Opptakskammeret leveres med karbagenmettet ACSF ved hjelp av en peristaltisk pumpe (figur 2A). Pumpen trekker først ACSF fra et begerbeger til et oppvarmet reservoar. Karbagenledninger plasseres i både...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Denne protokollen beskriver utarbeidelsen av horisontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skiver fra mus som viser spontan skarpbølge krusning aktivitet. Skiver inkuberes i et forenklet grensesnitt holder kammer og opptak utføres under nedsenket forhold med raskt flytende kunstig cerebrospinalvæske for å fremme vev oksygenering og spontan fremveksten av nettverksnivå aktivitet.

Akutt mus hjerne slicing å undersøke spontan hippocampal nettverksaktivitet

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Fastsettelse av Spontan Locomotor aktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Sammenkoblede hele cellen Recordings i organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akutt Adult Brain Slicing i Fysiologisk Temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Immunohistokjemisk Visualisering av hippocampus Neuron aktivitet Etter Spatial læring i en musemodell for nevrologiske lidelser

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induksjon av et isoelektrisk Brain State å undersøke effekten av endogent Synaptic aktivitet på neuronal Excitability<em&gt; I Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluering av Synapse tetthet i hippocampus gnager hjernen skiver

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En prekliniske modell for å vurdere Brain Recovery etter akutt hjerneslag i rotter

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Fremstilling av akutte menneskelige hippocampale skiver for elektrofysiologiske opptak

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...